雪茄煙葉工業輔料發酵研究進展

葉惠源 丁松爽,2 段旺軍黃明月 時向東,2

(1. 河南農業大學煙草學院，河南 鄭州 450002；2. 煙草行業煙草栽培重點實驗室，河南 鄭州 450002；3. 四川中煙工業有限責任公司技術中心，四川 成都 610066; 4. 四川中煙工業有限責任公司長城雪茄廠中式雪茄發酵重點實驗室，四川 德陽 618400)

雪茄是以經過發酵醇化后的雪茄煙葉為原料卷制而成的，相較于烤煙，其香氣更為濃郁、生理強度更大，具有獨特的風格特征[1]，其消費市場也迅速擴展[2]。目前雪茄煙生產的整個產業鏈過程中仍有很大的發展空間和潛力，這也為中式雪茄的發展提供了機遇[3]。與卷煙相比，雪茄的原料對產品的影響更大，國產優質雪茄原料的不足成為其產業發展的“卡脖子”問題，如何提高國產雪茄原料[4 -5]質量也成為亟待解決的問題。發酵是提升雪茄煙葉品質的關鍵環節。因此在雪茄煙葉發酵過程中外源添加微生物、酶類以及純天然產物等，以提高雪茄煙葉發酵品質、改善雪茄感官質量的研究成為了當今研究熱點。文章擬對雪茄煙葉輔料發酵及其對煙葉品質的改善作用進行綜述，并對其應用和研究前景進行展望，以期為國產雪茄的工業發酵提供依據。

1 微生物類添加物

1.1 煙葉中的原生微生物

煙葉中的微生物種類繁多、數量巨大，每克煙葉中大約有50 000～80 000個微生物，這些微生物主要屬于細菌和真菌[6]。Reid等[7]研究發現，發酵醇化后，雪茄煙葉表面的巨大芽孢桿菌以及青霉和曲霉數量較多。Tamayo等[8]發現西班牙煙葉中的芽孢桿菌和球菌數量較多。張曉娟[9]發現雪茄茄衣在人工發酵過程中，隨著發酵時間的延長，葉面上的微生物數量逐漸減少，其中芽孢桿菌數量較多，且活性較強，而巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是所有芽孢桿菌中的優勢菌株。李寧等[10]也認為發酵后雪茄煙葉表面微生物數量急劇減少，但細菌數量仍占絕對優勢，其中芽孢菌屬表現為優勢種群。張鴿等[11-12]研究表明，雪茄煙葉表面細菌主要為棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等，其中以芽孢桿菌屬為優勢細菌，其次是葡萄球菌。發酵過程中，煙葉中的原生微生物種類及豐度會發生變化，根據其對煙葉發酵的影響又可分為有害微生物和有益微生物。有害微生物不利于煙葉的品質形成，會對煙葉的外觀質量、物理特性及吸食品質產生不良影響，最終降低煙葉的工業可用性，且多在濕度大、溫度高、缺氧等不良發酵環境下產生，如霉菌、厭氧芽孢梭菌[13]、球桔青霉、黃曲霉[13]等。而有益微生物能夠通過自身代謝活動及產生的水解酶，作用于煙葉中的大分子物質從而促進物質的降解與轉化，生成對煙葉品質有積極作用的小分子物質，從而達到增香提質的目的。但不同微生物代謝過程及產生的酶類物質不同，因此對于煙葉品質而言發揮的作用也不相同，如假單胞桿菌可降低煙堿含量[14-16]，蠟樣芽孢桿菌[17]、微球菌[18]、嗜熱菌[19]等可降低蛋白質含量，芽孢桿菌和小球菌[8]等可增加煙葉香氣物質。

1.2 可人工添加的有益微生物

在煙葉發酵過程中合理有效地利用微生物資源的代謝特點，外源添加有益微生物以提高雪茄煙葉葉面功能菌株的種類及數量從而促進煙葉內的生化代謝，實現針對性的增香提質，降刺減害[20-22]。目前，用于煙葉發酵的可添加有益微生物主要是真菌類的酵母菌[23]以及米根霉[24]、黑曲霉[25-26]、青霉、毛霉、根霉[27]等霉菌，細菌類的枯草芽孢桿菌[28-30]、陰溝腸桿菌[31]、蘇云金芽孢桿菌[32]、短小芽孢桿菌[33]、環狀芽孢桿菌[13]、蠟樣芽孢桿菌[17]、假單胞菌[16,34]、纖維單胞菌、節桿菌等。可人工添加的微生物除了從煙葉上篩選分離出的有益菌株外，還可利用土壤、茶葉、酒糟等物質中的功能菌株對煙葉進行發酵，如釀酒酵母、冠突散囊菌、米根霉等具有產香降刺作用的微生物。

1.3 外源添加微生物對煙葉品質的改善作用

1.3.1 加快發酵進程 雪茄煙葉經調制后一般要經過兩次以上發酵，1～2年醇化方可投入使用，而外源添加微生物可在一定程度上促進內含物質轉化進而縮短發酵進程。Koller[23]嘗試在雪茄煙葉上添加酵母菌進行發酵，使雪茄煙葉發酵得更徹底。余玉莎等[24]研究發現，加入枯草芽孢桿菌可使煙葉內含物質轉化加快，可將發酵進程由20 d縮短至8 d。韓錦峰等[6]將天然存在于煙葉內的優勢菌種芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌混合用于煙葉發酵，證實了微生物類添加物可加速葉內化學成分的轉化從而縮短發酵進程，改善煙葉質量，同時還可抑制霉變。但在使用上述微生物類添加物的過程中，若不能很好地控制發酵環境，也會促進一些不利于煙葉品質的細菌、霉菌生長。庹有朋等[35]利用從煙葉上分離出的優勢菌株對煙葉進行發酵，在合理控制發酵環境的前提下發酵7個月可達到現有發酵技術發酵3年的效果。

1.3.2 協調化學成分 在發酵過程中添加具有降解煙堿能力的微生物可較好地彌補因煙葉煙堿含量過高而引起的刺激性強、雜氣明顯、吃味辛辣等不足。李躍鋒等[13]發現在煙葉發酵時添加枯草芽孢桿菌和環狀芽孢桿菌能夠增進煙葉香氣，降低煙堿含量。 Gutierre[31]利用從煙葉上分離出的陰溝腸桿菌對煙葉進行發酵發現，其具有降解煙堿的能力，還能代謝煙酸，從而協調煙葉的化學成分。胡希[36]將從煙草上分離出來的菌株4-b和x-3兩種細菌應用到雪茄煙葉上進行發酵后發現，總植物堿降解率較對照分別增加了22.43%，33.34%，揮發堿降解率較對照分別增加了26.00%，15.18%。說明功能菌株的外源添加可顯著降低煙葉中煙堿含量且使其降解得更加充分，這也有利于含氮類香氣物質的增加及煙葉安全性的提高。淀粉含量高不僅會影響煙草制品的燃燒性、增加焦油含量[32]，還會對其色、香、味產生不良影響，而利用微生物技術是有效促進淀粉降解、改善煙葉品質的有效途徑之一。馮穎杰等[32]利用高效產淀粉酶的蘇云金芽孢桿菌對煙葉進行發酵后發現，淀粉降解率高達29.84%。張曉瑞等[29]從初烤煙葉上分離出枯草芽孢桿菌HX-6，將其作用于煙葉再進行發酵后發現淀粉降解率達31.75%。而利用枯草芽孢桿菌亞種發酵后煙葉中淀粉降解率則高達33.87%[30]。除芽孢桿菌外，紀旭東等[25]將產酶活性高的黑曲霉應用到煙葉發酵中,發現可明顯縮短煙葉的發酵周期，加快淀粉向糖類物質的分解轉化，最終使煙葉的化學成分更加協調。

蛋白質作為煙葉的含氮化合物之一，其含量高低較大程度上影響了煙葉的吸食品質，含量過高會使燃吸時煙葉的辛辣刺激感加劇，并產生燃燒羽毛的不良氣味[30]。李寧等[17]將煙葉中具有產蛋白酶作用的蠟樣芽孢桿菌施加在雪茄煙葉上發酵，蛋白質降解率較對照增加了12.94%。楊宗燦等[33]從煙葉上分離出短小芽孢桿菌并將其應用于煙葉進行發酵，蛋白質降解率可達29.66%。馬玲玲[30]利用高效產蛋白酶的枯草芽孢桿菌亞種對煙葉進行發酵，蛋白質含量降低了20.00%。綜上，發酵過程中利用微生物資源可以有效降解蛋白質，改善煙葉的吸食品質。

煙草細胞壁物質由纖維素、半纖維素、木質素、果膠質和一些礦質元素構成，對煙草品質有較大影響，其中纖維素、果膠質等含量過多均會對煙草制品的吸食品質造成不良影響。別小妹等[34]利用具有多重降解效果的蓋氏假單胞菌的粗酶液發酵煙葉，其果膠、木質素降解率較對照分別增加了9.34%，23.11%。龍章德等[37]將煙葉醇化過程中發現的一株產纖維素酶和漆酶的芽孢桿菌Bacillussp. GYC30應用于煙草薄片，其能夠有效降解煙草薄片原料中的纖維素和木質素。

1.3.3 增進煙葉香氣成分含量 微生物可通過自身代謝影響內含物質轉化，使煙葉內的香氣前體物質含量增加，從而達到增加煙葉香氣的目的。Kowiwaia等[38]、Tamayo等[8]均認為在雪茄煙上接種芽孢桿菌和小球菌等有益煙葉源微生物能夠提高煙葉香氣。余玉莎等[24]用米根霉發酵煙葉后發現，酮類和醛類致香成分總含量增加，其中棕櫚酸乙酯增幅最大為101.58%，面包酮次之。李寧等[17]將煙葉中的蠟樣芽孢桿菌經篩選擴大培養后，將其施加在雪茄煙葉上再進行發酵，可以促進蛋白質的降解，從而生成氨基酸發生美拉德反應，增進煙葉香氣。胡志忠等[39]研究發現利用從煙葉表面分離得到的產香酵母對煙葉進行發酵，與對照相比共新增了6種香味物質，可豐富煙葉香氣風格，增進煙葉香氣量。杜飛等[40]利用從茅臺酒酒糟和茯磚茶中分離出的釀酒酵母和冠突散囊菌用于煙葉發酵，可增加香茅醇、乙醇、檸檬烯、苯乙醇等香味物質含量。此外，還可配以其他輔料物質為所添加的微生物創造良好的生長環境使其能發揮更好的作用。景延秋等[41]利用枯草芽孢桿菌、放線菌和小球菌組成的復合菌懸液、葡萄糖、氯化鉀、表面活性劑、水組成的發酵溶液明顯提高了煙葉的香氣含量，并賦予煙葉獨特的清甜香和花香。

1.3.4 改善吸食品質 呂欣等[42]將從煙葉上分離出14株煙用增香微生物分別接種到煙葉上進行發酵，經微生物處理后，煙葉的煙氣濃度、香氣量、細膩感等得以明顯改善。全銘沁等[26]利用黑曲霉對煙葉進行發酵，將所得發酵液與生物酶配制成復合劑用于煙葉發酵，煙葉的香氣有明顯改善，青雜氣下降，余味舒適。王紅霞等[27]利用酵母、青霉、黑曲霉、毛霉、根霉中的一種或幾種任意比例混合物用于雪茄煙葉發酵，原料的糖氮比得到了一定平衡，有效克服了燃吸時由于酸堿不平衡所導致的辛辣、苦澀等缺陷，并且改善了雪茄煙葉中青雜氣和刺激性等問題，改善了煙葉的燃吸品質，提高了雪茄煙葉的工業可用性。

2 酶類添加物

2.1 煙葉中的酶

酶是影響煙葉發酵的內在因素之一，也是促進煙葉內含物質轉化的主要原因，不同催化作用的酶共同在煙葉發酵過程中發揮作用，使發酵后的煙葉達到工業可用性的要求[43-45]。煙葉中的酶主要為水解酶和氧化還原酶兩大類，水解酶主要有淀粉酶、糖苷酶、麥芽糖酶、蛋白酶、酯酶、葉綠素酶、肽酶和轉化酶等，氧化還原酶主要包括曲酶、過氧化酶、氧化酶和脫氫酶等。這些酶類物質主要來源于兩方面：① 煙葉自身存在的酶，② 微生物以煙葉中的蛋白質、淀粉等為營養源，進行自身代謝最終合成具有生物活性的不同種類的酶[43]。煙草發酵過程中，不同微生物影響不同酶的活性，微生物的變化會使煙葉內酶活性發生相應的變化[22]。煙草發酵或加工過程中，不同的酶對發酵產生的作用不同，由于調制結束后煙葉的酶含量及活性均下降，因此根據煙葉所需要解決的質量問題進行選擇添加酶及其酶制劑，可以有效降低煙葉中的不利成分含量，促進大分子物質的降解轉化，減少燃吸時的不良氣味及刺激性，提高感官評吸質量，使煙葉由于在田間栽培措施或調制方法不當等引起的品質不足得到改善[46-48]。

2.2 外源添加酶對煙葉品質的改善

2.2.1 協調煙葉化學成分 煙葉中的淀粉、蛋白質含量會對其吸食品質產生一定的影響，為了使這些大分子物質更好地降解轉化，一些學者將相應的酶應用于煙葉發酵且得到了較好的效果[49]。研究[50]表明，外源添加α-淀粉酶和糖化酶進行發酵，能夠促進碳水化合物的降解轉化，降低淀粉含量，提高水溶性糖含量，從而使煙葉化學成分更協調，中和煙氣堿性，降低刺激性，增加甜感，使煙葉品質得到改善。寇明鈺等[51]利用中性和堿性蛋白酶對茄芯煙葉進行發酵，芯葉蛋白質含量分別降低了18.98%，17.54%，而用適當比例的中性蛋白酶和堿性蛋白酶處理雪茄茄芯煙葉后發現，煙葉中的蛋白質降解率可達25.38%，說明在合適的發酵環境下復合酶對煙葉的作用效果要強于單一酶。李曉等[52]將蛋白酶和淀粉酶、糖化酶混合處理煙葉后發現，與對照相比蛋白質降解率增加了33.1%，且水溶性糖含量也相應有所提高。除了單獨添加酶或制成復合酶劑使用，趙銘欽等[53]在利用高生物活性酶的基礎上添加了優勢增香菌種，此種發酵增質劑可以在更加短的時間內使煙葉化學成分協調，香氣物質含量增加，雜氣、刺激性有所減小，舒適感增強。但在使用復合發酵劑處理煙葉時應調整合適的處理條件，使不同的酶或微生物菌劑都能最大程度地發揮作用，更加有效地改善煙葉品質。

2.2.2 增進煙葉香氣成分含量 外源添加酶類物質可以促進煙葉中香氣前體物等內含物質的降解轉化，最終實現增香提質的作用。者為等[54]認為利用纖維素酶、果膠酶、酸性蛋白酶、中性脂肪酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶組成的復合酶添加劑對煙葉進行發酵可顯著增加煙葉的致香成分總量，且經發酵后的煙葉醇化8個月與對照醇化24個月的致香成分含量接近。Bailey等[55]使用硝酸鹽還原酶和蔗糖轉化酶對煙葉處理后發現，隨著發酵時間的延長，煙葉的甜香感逐漸濃郁且香氣更加豐富。任軍林等[56]將高活性微生物轉化酶添加到煙葉上，煙絲色澤油潤且具有優雅、豐滿的香氣。此外，也可在輔料的協同作用下，促進煙葉香氣物質的形成。毛耀等[57]使用扣囊復膜孢酵母和天冬酰胺酶混勻的水溶液對白肋煙進行發酵，并在加料增溫增濕時再次噴灑弱堿性天冬酰胺酶和氨基酸混合溶液，以此來加強發酵過程中的美拉德反應，增加致香物質及其前體物包括Strecker醛類物等含量。而龍章德等[58]利用酶解—美拉德強化修飾聯用技術即在果膠酶—漆酶復合酶處理的基礎上添加氨基酸、短肽和果糖進行美拉德反應，從而豐富煙草薄片的香氣。

2.2.3 改善吸食品質 將纖維素酶、果膠酶等酶類物質應用于煙葉發酵，可使不利于煙葉品質的細胞壁物質降解，并改善了由其引起的刺激性較大、吸食品質不佳、安全性低等問題[59]。李力群等[60]通過纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶、葡聚糖酶和類黃酮合成酶類組成的復合酶對雪茄煙葉進行發酵，煙葉的勁頭、雜氣和刺激性顯著降低，總體質量得到了提高。張立昌[61]研究表明酶制劑的應用可以豐富煙葉的香氣，減輕吸食時的不良感受，改善煙葉品質。阮祥穩等[62]用纖維素酶和蛋白酶組成的復合酶在適宜條件下發酵較短時間后發現，煙葉青雜氣減輕，刺激性有所降低，感官評吸總得分較對照增加了17.3。復合酶發酵煙葉的效果較好，但能投入使用的復合酶配方及配套的工藝措施都需要不斷地篩選調整，適宜復合酶比例、發酵的溫濕度及時間等都是酶制劑發揮最優作用的關鍵，李洪濤等[63]采用正交試驗將蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶、酸性木聚糖酶等單獨添加到煙葉上進行發酵，利用評吸結果得出了適宜的添加劑配方比例，最終實現了改善煙葉香氣、吸食品質的目標。

3 輔料類添加物

3.1 常用于雪茄煙葉發酵的輔料

工業上為了達到加深和均勻雪茄煙葉顏色，提高煙葉的香氣以及改善吃味的目的，會在煙葉發酵時添加一些輔料[64]。如四川什邡對當地生產的雪茄煙葉采用傳統的糊米發酵法和紅米發酵法即利用輔料對煙葉進行發酵前處理，最終使發酵后的煙葉色澤均勻，香氣吃味得到改善[45]，其中糊米發酵是指將大米炒制、焦化到一定程度后，放入適量冷開水熬煮一段時間，水變成褐色，冷卻后過濾得到糊米水，并將一次發酵后的煙葉用糊米水浸漬后進行發酵[65]；紅米發酵法是指在煙葉堆積發酵前向煙葉上添加紅米漿，這兩種傳統發酵工藝，能夠使茄芯的香氣吃味更加濃郁飽滿，煙葉的燃燒性得到改善，使煙葉色澤紅亮、軟綿[65]。這主要是由于糊米水及紅米漿可以為煙葉發酵提供營養物質且自身的理化特性可加速發酵過程中的化學反應從而提高發酵質量。但這兩種發酵工藝需投入的成本較高，不適宜大規模推廣[4]。此外，工業上用于煙葉發酵的輔料添加物還有菊花浸提液、米酒稀釋液、桂花提取液、冬青膠等。輔料添加物質對于煙葉品質的改善作用主要通過三方面實現：① 增加煙葉表面的微生物及酶的豐富度[66-67]；② 輔料添加物自身的酸堿特性也有利于促進煙葉的酸堿度平衡；③ 輔料物質與煙葉中的物質發生的特殊的生化反應。

3.2 外源添加輔料對煙葉品質的改善作用

3.2.1 協調煙葉化學成分 徐世杰[50]研究發現，與清水對照相比，煙葉經菊花、綠茶浸提液、米酒處理液處理后，糖堿比、鉀氯比值均有所提高[45]，其中米酒處理效果最佳，與對照相比，分別增加了0.07，1.30。殷全玉等[68]使用葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮等輔料發酵煙葉來促進煙葉內含物質的轉化，其中聚乙烯吡咯烷酮處理與清水處理相比還原糖含量增加了2.61%，煙堿含量降低了0.18%，上部葉品質得到了明顯改善。顧國早[69]將定色后的干煙葉放入糊茶水中浸泡后再進行發酵，最終得到了煙堿、糖分、鉀等化學成分協調的煙葉。

3.2.2 增進煙葉香氣成分含量 李凌[67]研究發現米酒處理能使煙葉中的茄酮及棕色化產物類香氣物質含量增加，與清水對照相比，煙葉的品質有明顯提升，且在發酵時添加不同的輔料物質如綠茶浸提液、稀釋米酒、稀釋純牛奶等，可以從不同方面改善煙葉品質。劉鴻等[70]利用冠突散囊菌發酵六堡茶茶葉制得金花菌茶葉，然后將其與復烤煙葉共同發酵，利用茶葉上的微生物使發酵后煙葉的甜度增加且帶有茶葉的清香。此外，美拉德反應是煙葉香氣物質生成的重要途徑之一，李林林等[71]以雪茄煙末酶解液為反應基液，外加不同氨基酸及糖類組合物質進行美拉德反應，將所得產物添加到雪茄煙葉上可促進香氣物質的生成，且不同處理后的雪茄煙葉中大部分對雪茄煙葉風味特征有貢獻的風味物質有不同程度的增加，如適當比例的谷氨酸和木糖處理后的雪茄煙葉的苯甲醇、二氫獼猴桃內酯、新植二烯含量較清水處理分別增加了3.92，5.03，270.47 μg/g，可較好地促進雪茄煙風格的彰顯，增加雪茄煙香氣豐富度。

3.2.3 改善吸食品質 發酵過程中向煙葉中添加適宜濃度的葡萄糖水溶液或檸檬酸水溶液，能夠減少發酵后煙葉給吸食者帶來的不良感受，如余味過苦，刺激性過大等；這是因為葡萄糖能生成酸性物質，而檸檬酸也具有酸性，這兩種物質可以中和煙葉的堿性，改善煙葉的吸食品質[72]。黃洋等[73]利用冬青中的冬青苷類成分在一定溫濕度環境下可降解為小分子致香成分的特性，將其與咖啡提取物混合而成的發酵添加劑用于煙葉發酵，可賦予煙葉抽吸愉悅、醇甜潤綿的風格特征。邊文杰等[74]通過在煙葉中添加活化后的安琪酒曲并醇化發酵，實現了煙葉的增香效果，并降低了煙葉的刺激性，最終使煙氣更加細膩柔順、煙葉品質明顯改善。黃銳[75]將苦蒿與浸水煙葉共同堆放并發酵使其在密封高溫環境下反應，使有益微量元素含量增加，口感更為干凈、飽滿、醇正，減少刺喉、刺鼻感，提高了煙葉的安全性。史宏志等[76-77]將配置好的褪黑素、薄荷酮混合液噴施到pH適當的雪茄煙葉上進行發酵，煙葉中的亞硝胺含量分別可降低14.61%～17.83%，45.19%，煙葉的安全性較顯著提高，其原因是由于薄荷酮通過抑制硝酸還原酶活性，進而降低發酵后雪茄煙葉中的亞硝胺含量。因此，輔料類添加物的使用對于煙葉降焦減害方面也大有裨益。

4 結語及展望

雪茄煙葉發酵是雪茄煙葉品質提升的重要過程，而微生物、酶及輔料類的外源添加物可一定程度改善發酵后雪茄煙葉品質。但目前中國關于雪茄煙葉工業發酵外源添加物的研究仍不夠深入，關于微生物、酶在發酵過程中的活性變化規律等的研究還不夠系統，在此基礎上提出的有益菌株、酶類篩選再添加技術還有很大的研究空間。關于從其他物質如茶類、酒類等篩選出的優勢菌株對雪茄煙葉本身的風味特征的影響還欠缺較為系統的研究。輔料類物質添加對于發酵品質的影響機理，外源添加物在雪茄煙葉發酵中發揮最大作用的最適條件以及其可能帶來的不安全性等方面都是今后需要繼續研究的重點。根據所需達到的發酵目的，定向選擇外源添加物并輔以配套的發酵技術，定向調控雪茄煙葉的發酵品質和風味特征，將對于提高中國雪茄煙葉品質，促進國產雪茄產業發展具有至關重要的意義。