四川產區藍莓病原真菌的分離鑒定及精油成分對其的抑菌作用

劉春燕 丁 捷 鄧尚貴 秦 文 劉 艷

(1. 浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316000；2. 四川農業大學食品學院，四川 雅安 625000；3. 四川旅游學院食品學院，四川 成都 610100)

四川省是中國主要的藍莓鮮果供應地，2020年的總產量為5.0萬t，位居全國第二[1]。藍莓采后極易被病原真菌侵入造成腐爛發霉，分離鑒定藍莓采后致腐的主要病原真菌是防治的關鍵，但侵染藍莓致腐的病原真菌地域差異性較大。遼寧地區的病原真菌主要是灰葡萄孢、鏈格孢、青霉、粉紅單端孢菌和產黃青霉[2-3]；浙江杭州的主要致腐病原真菌為灰葡萄孢、木霉和青霉[4]；貴州麻江縣的采后腐爛病原真菌為間座殼屬、鏈孢霉、球黑孢霉、內生真菌和灰霉菌[5]。目前尚未見四川產區藍莓采后病原真菌的研究報道。

化學試劑殺菌是防治果實采后真菌性病害的主要途徑，但頻繁和高濃度的使用會造成環境和食品污染，還易誘導病原菌產生抗藥性[6]，因此尋找安全高效的天然抗菌劑成為當務之急。王丹等[7-8]發現植物精油對果實采后病原菌的抑制效果較好。但植物精油中有效成分含量及生理活性受多種因素影響，其抑菌穩定性較差[9]。因此，精油成分對常見采后病原真菌的抑制逐漸成為研究熱點[10-12]。目前已有香茅醇、丁香酚及麝香草酚等多種精油組分的相關報道[9,13]。研究擬以四川產區藍莓在低溫貯藏期的病果為試材，分離純化病原真菌，并以優勢病原真菌為目標菌株，篩選具有廣譜抑菌效果的精油成分，以期為藍莓采后病害防治和新型抑菌藥劑研發提供理論依據。

1 材料與試劑

1.1 原料及處理

藍莓(VacciniumSpp.)：采自四川省的14個商業種植基地，采摘后當日冷鏈運回實驗室，剔除殘次、病蟲害及機械損傷的果實，挑選成熟度、顏色、大小基本一致的藍莓為試材，于(2.0±0.5) ℃，RH 85%機械冷庫中貯藏備用。

1.2 儀器設備及試劑

萬分之一電子天平：FA2204B型，上海佑科儀器儀表有限公司；

高壓滅菌鍋：GI54DS型，廈門致微儀器有限公司；

生化培養箱：LRH-250F型，上海一恒科學儀器有限公司；

智能恒溫恒濕培養箱：LHS-250型，鄭州生元有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2D型，武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司；

顯微鏡：E100型，日本Nikon公司；

乙醇：分析純，成都科隆化學試劑公司；

姜酮(97%)、香茅醇(95%)、丁香酚(99%)、D-檸檬烯(95%)、桉葉素(80%)、香芹酮(95%)、莰烯(75%)、月桂烯(90%)、松油醇(98%)、松油烯(95%)、麝香草酚(98%)、β-蒎烯(98%)、二烯丙基硫醚(98%)、肉桂醛(98%)、香芹酚(99%)：分析純，羅恩試劑上海易恩化學技術有限公司。

1.3 藍莓貯藏病原真菌的分離與純化

采用常規組織分離法分離病原真菌。取果實病原交界處的組織(5 mm×5 mm)，分別用75%酒精和0.1%升汞處理30 s，無菌水沖洗后接種至PDA培養基上，于28 ℃ 培養48 h。挑取菌落邊緣純化3～5代，保存斜面備用。選擇疑似病原真菌菌株，以有傷接種和無傷接種兩種方式進行驗證。以接種空白菌餅的為對照組，將培養皿置于25 ℃、RH 90%恒溫恒濕培養箱中培養3～5 d。觀察記錄發病情況，按照柯赫氏法則，驗證藍莓貯藏疑似病原真菌的致病性。

1.4 病原真菌形態特征觀察及分子鑒定

將病原真菌接種到PDA培養基上，28 ℃培養3～5 d，觀察記錄單菌落形態和菌絲孢子結構特征，參照真菌形態學鑒定手冊進行分類鑒定。

采用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對純化病原真菌的基因組DNA進行PCR擴增后測序，利用SnapGene軟件處理測序結果。將病原真菌序列和NCBI進行Blast比對，選取與病原真菌同源性高和形態相似的菌株序列構建系統發育樹。

1.5 溫度和光照對藍莓采后優勢及亞優勢病原真菌菌絲生長的影響

采用點植法接種病原真菌，培養5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，分析環境溫度(5，10，15，20，25，28，30，32，35，38 ℃)和光照條件(24 h全光照、12 h光暗交替的半光照和24 h全黑暗)對菌絲生長的影響。

1.6 基于信息熵法初篩具有廣譜抑菌活性的精油成分

以四川產區藍莓采后主要病原真菌為目標菌株，將供試精油成分用無水乙醇配制成有效質量濃度100 mg/L 的含藥PDA培養基，采用點植法接種病原真菌。在28 ℃ 下培養5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，根據相對抑制率，用信息熵法綜合評判精油組分的抑菌率。按式(1)計算菌絲生長相對抑制率。

(1)

式中：

R——相對抑制率，%；

A1——對照組直徑，mm；

A2——處理組直徑，mm。

1.7 麝香草酚對藍莓采后優勢及亞優勢病原真菌的體內外抑菌活性

分別設置麝香草酚不同質量濃度(0，20，40，60，80，100，120，150 mg/L)的帶藥平板，采用點植法接種后置于28 ℃避光倒置培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算相對抑菌率。參考Aspera-Werz等[14]的方法使用AAT BioQuest的EC50計算器工具(https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator)，計算麝香草酚對不同菌株的半數有效濃度(EC50)。以無菌水處理為對照，每個濃度設置4個重復。

將Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25分別在PDA上培養5 d后制備1×107CFU/mL混合孢子懸浮液，噴灑到果子表面后晾干備用。以空白處理為對照，根據麝香草酚對不同菌株的半數有效濃度，將不同質量濃度(10，30，50，70 mg/L)的麝香草酚-1%吐溫80水溶液噴施于已接種的藍莓果實表面，分別標記為W10、W30、W50、W70。自然晾干后裝入經75%酒精滅菌的塑料盒[(125±10) g/盒]，置于(2.0±0.5) ℃條件下貯藏，間隔2 d 監測藍莓果實的發病情況。

Ir=n/N×100%，

(2)

式中：

Ir——發病率，%；

n——發病果子數量；

N——總的果子數量。

2 結果與分析

2.1 四川產區藍莓采后發病情況調查

藍莓果實在低溫貯藏14 d后開始長霉腐爛，典型發病果實癥狀主要分為軟潰腐爛(Q1型)、果蒂長毛腐敗(Q2型)和青霉病(Q3型)3大類，其中Q1型軟潰腐爛癥狀最為常見。Q1型病果表現為果實表皮上密生黑色粒狀霉層，后期形成水漬狀塌陷腐敗區，果皮明顯變薄且組織崩潰，果肉全部變紅或褐變。Q2型病果主要是果蒂長毛腐爛，果蒂表層凸起絮狀白色或灰色菌絲，與周圍病果形成片狀的霉層，后期菌絲滋生處果皮組織崩潰，果肉部分變紅或褐變，伴有軟糊狀汁液滲出。Q3型病果在初期果蒂周圍形成白色霉層，后期產生大量孢子，在果實表面形成致密狀的青色或灰綠色霉層，感染處扁平或塌陷，果肉發生一定程度褐變，靠近果皮部位的果肉變紅。

2.2 藍莓采后病原真菌的分離頻率及致病性

由表1可知，Q1W1是四川產區藍莓采后病原真菌優勢種，其分離頻率為32.63%；Q2W22、Q3W25、Q2W19和Q3W7是亞優勢種，分離頻率>10%。Q1W11、Q2W13、Q2W20和Q2W26是第三大優勢種群，分離頻率<5%。由致病返接試驗可知，上述菌株均為藍莓采后致病菌，其反接致病癥狀與自然發病癥狀相似，且有傷接種的病害程度強于無傷接種，而對照組未見發病。在有傷接種條件下，優勢種和亞優勢種的發病率無顯著差異(P>0.05)，Q1W1、Q2W19和Q2W22返接5 d后果實發病率為100%，Q3W7和Q3W25的發病率分別為92.59%和88.89%；而在無傷接種條件下，Q1W1、Q2W19和Q2W22的發病率均超過50%，其中Q1W1最高(62.96%)。綜上所述，Q1W1是四川產區藍莓低溫貯藏期分離頻率和發病率最高，且傳染性最強的采后病原真菌，其發病癥狀同黑曲霉在棗果中的報道一致[15]，故暫將其在藍莓上引發的癥狀稱為藍莓采后黑霉病。

表1 四川產區采后病原真菌相對分離頻率和致病性?Table 1 Relative isolation frequency and pathogenicity of postharvest pathogens in Sichuan

2.3 藍莓采后病原真菌的形態學特征

從發病果實病原交界處分離得到95株真菌，根據菌落形態和孢子形態初步分為9種，如圖1所示。

圖1 藍莓采后病原真菌的菌株形態、孢子形態和回接癥狀Figure 1 Morphological characteristics of isolated strains and their symptoms after reconnection with blueberries

Q1W1和Q1W11菌落平坦而整齊，氣生菌絲為白色短絨狀，孢子在48 h后產生，但Q1W11的孢子更質密；顯微鏡下兩株菌株的分生孢子頭均為球形且菌絲光滑，無隔膜和分支，可初步判定為曲霉屬。

Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22和Q2W26的菌落均呈絨毛狀，菌絲為白色或者褐色，其中Q2W13需要在無菌松針(馬尾松)的水瓊脂培養基上才能產孢[16]；Q2W19在培養8 d后開始產孢。顯微鏡下的菌絲均細長；Q2W19的分生孢子呈燒瓶形，含5個細胞，具有4個分隔，頂端和基部各有附屬絲2，1根；Q2W22的分生孢子呈倒棒狀，有橫隔；Q2W26的孢子梗頂端著生球形孢子囊，分生孢子為近球形或橢圓形。根據病原真菌的形態學特征結合參考文獻[17]，將Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22和Q2W26初步鑒定為小新殼梭孢菌、類擬盤多毛孢屬、禾谷鐮刀菌、鏈鉻孢屬、毛霉屬。其中鏈鉻孢在東北和華東地區的藍莓采后病原真菌中有相關報道。

Q3W7和Q3W25的菌落均呈地毯狀，其中Q3W7菌落較平坦，而Q3W25菌落表面褶皺且營養菌絲深入培養基內部。在顯微鏡下Q3W7的分生孢子梗形如掃帚，分生孢子呈球形；而Q3W25的分子孢子頂生或側生，形成短鏈，呈橢球型。根據病原真菌的形態學特征結合相關文獻[2,18]，Q3W7和Q3W25初步鑒定為青霉屬、枝孢菌屬。青霉和枝孢菌主要是中國西南產區藍莓采后的病原真菌。

2.4 藍莓采后病原真菌的分子生物學鑒定

由圖2可知，Q1W1和Q1W11分別和曲霉屬中AspergillusnigerATCC16888，AspergillustubingensisNRRL 4875的親緣關系比較接近，結合菌落形態分別鑒定為黑曲霉、塔賓曲霉菌。Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22、Q2W26分別與NeofusicoccumparvumstrainWZ-92、Neopestalotiopsissp.isolate2177、FusariumgraminearumisolateNRRL28302、AlternariaalternataisolateUASB8、MucorfragilisstrainLMSA 1.09.161的親緣關系比較接近，結合菌落形態分別鑒定為小新殼梭孢菌、類擬盤多毛孢菌、禾谷鐮刀菌、互生鏈鉻孢菌和毛霉。Q3W7、Q3W25分別與Penicilliumsp.SAF6-EGY、CladosporiumxylophilumisolateFR1801的親緣關系接近，結合菌落形態分別鑒定為噬木枝狀枝孢菌、青霉菌。

圖2 藍莓采后病原真菌的系統發育Figure 2 Phylogenetic tree of postharvest pathogens of blueberry

2.5 溫度和光照對藍莓采后優勢及亞優勢病原真菌菌絲生長的影響

由圖3可知，溫度和光照對不同病原真菌菌絲生長的影響存在較大區別。Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的菌落直徑均隨溫度的升高呈先增加后降低的趨勢；其中Q2W22的生長溫度范圍最廣，在10～38 ℃的范圍內均能生長；Q3W25的生長溫度范圍最小為15～30 ℃。根據菌落大小，Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的最適生長溫度分別為35，20，30，30，25 ℃。Q1W1、Q2W19和Q3W25最適宜光照條件為12 h光暗交替，Q2W22的最適宜光照是24 h光照，而Q3W7菌株的菌絲生長情況與培養期間光照時長無顯著相關性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 溫度和光照對藍莓采后病原真菌生長的影響Figure 3 Temperature and light on the growth of postharvest pathogenic fungi of blueberry

2.6 基于信息熵法初篩具有廣譜抑菌活性的植物精油成分

將15種精油成分對藍莓采后優勢菌株的5 d生長抑制率通過信息熵重新確定權重系數，Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的權重系數分別為0.364 158，-0.127 020，-0.009 360，0.536 662，0.235 562。根據式(3)計算綜合抑制率，其值越大說明該精油成分的廣譜抑菌效果越好。由表2可知，麝香草酚的綜合抑制率最高為100%，其次是香芹酚(63.77%)、二烯丙基硫醚(36.20%)、肉桂醛(30.75%)、β-蒎烯(22.01%)和香茅醇(18.39%)，其余9種精油成分的綜合抑制率均小于5%。

F=0.364 158R1-0.127 020R2-0.009 360R3+0.536 662R4+0.235 562R5，

(3)

式中：

F——綜合抑制率，%；

R1、R2、R3、R4、R5——Q1W1、Q3W7、Q2W19、Q2W22和Q3W25菌絲的相對抑制率，%。

2.7 麝香草酚對藍莓采后優勢和亞優勢病原真菌體內外抑菌活性

麝香草酚對藍莓采后優勢和亞優勢病原真菌體內外抑菌活性見圖4。由圖4(a)可知，Thymol對Q2W22的抑制活性最小，EC50為(55.33±8.03) mg/L，顯著高于其他菌株；而Q2W19、Q3W25、Q3W7和Q1W1的室內毒力無顯著差異，其EC50分別為(29.80±3.65)，(31.98±2.07)，(35.35±7.42)，(38.18±7.56) mg/L。前人研究發現以麝香草酚為主要成分的百里香精油對鏈鉻孢的EC50為18.456 μL/L[8]，肉桂—山蒼子復合精油對黑曲霉的最小抑菌濃度為0.125 μL/mL[19]，均小于麝香草酚對中黑曲霉的EC50(38.18 mg/L)及鏈鉻孢的EC50(55.33 mg/L)。這可能是由于精油是多種抑菌物質混合物，因此抑菌效果優于單一組分麝香草酚。但植物精油中的醇類、醛類和烯類物質因其原料來源和提取工藝差異性較大，對特定抑菌活性的貢獻度是不確定、不穩定的[20]，因此極大限制了植物精油采后處理效果的穩定性。

由圖4(b)可知，在整個常溫貯藏期間，所有麝香草酚處理組的采后病害發病率均低于CK，均能有效控制真菌病害。W10組的發病率在4～8 d內顯著低于同期的其他組。而W50和W70的發病率在常溫貯藏4 d后急劇增加，分別為50.69%和53.90%，而W10僅從16.24%增加到31.92%。這可能是由于麝香草酚具有高植物毒性[21]，超過50 mg/L的施用濃度可能導致果實嚴重藥害。

3 結論

以低溫貯藏下自然發病的四川產區藍莓為試材，共分離得到95株真菌，其中Aspergillusniger、Neopestalotiopsissp.、Alternariaalternat、Penicilliumsp.和Cladosporiumxylophilum是四川產區藍莓采后的主要病原真菌。這5株菌的最適生長溫度分別為35，20，30，30，25 ℃，其中Penicilliumsp.對光照反應不敏感，而其他菌株敏感。麝香草酚對上述5株菌的抑制效果較好，其半數有效濃度范圍為30～50 mg/L。研究還發現麝香草酚水溶液的施用濃度和實際采后病害防治的應用效果不呈正比。因此較低濃度的麝香草酚水溶液具有防治藍莓采后病害的潛力，可在未來作為廣譜抑真菌成分研發高效安全的新型采后緩釋抑菌劑。