高效液相色譜—串聯質譜法測定油菜和油菜籽中草除靈殘留量

竇銀花

(上海必諾檢測技術服務有限公司，上海 201114)

草除靈是一種專效性芽后傳導性除草劑，用于油菜田防除豬殃殃和繁縷，對油菜安全，對闊葉雜草有效，具有內吸傳導作用[1-2]。其可以經由食物鏈、環境最終遷移至人和畜體內。GB 2763—2016規定：草除靈于油菜籽內的最大殘留限量(MRL)為0.2 mg/kg。從2004年開始，國際標準禁止了除草靈的上市與應用[3]。

食品中農藥殘留分析是在復雜的基質內定性與定量分析目標化合物。對于農藥殘留而言，其分析步驟主要為提取、凈化、檢測，前2步為前處理，與分析結果的準確性和可靠性直接相關。目前中國還沒有關于草除靈的檢測標準，主要采用液相色譜法[3-5]和氣相色譜法[6-8]進行檢測，而采用液相色譜—質譜聯用法(LC-MS)測定草除靈的文獻較少[9-12]。研究擬采用乙腈提取，經固相萃取柱凈化，LC-MS聯用技術測定油菜、油菜籽內草除靈殘留量，旨在為草除靈的測定提供一種有成效的科學測試方法。

1 試驗部分

1.1 試驗設備

電子分析天平：BL60S型，德國賽多利斯公司；

渦旋振蕩器：945616型，美國Talboys公司；

搗碎機：FA25型，德國FLUKO公司；

高速冷凍離心機：Sovall ST16R型，美國賽默飛世爾公司；

氮吹儀：DC-24型，上海安譜實驗室科技股份有限公司；

高效液相色譜—質譜聯用儀：Agilent infinityⅡ1290/QQQ 6470B型，美國安捷倫公司。

1.2 試劑與材料

油菜、油菜籽：市售；

乙腈、正己烷、甲苯：色譜純，美國Sigama公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

草除靈標準物質：(99.30±2.30)%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

石墨化炭黑—氨基復合柱：500 mg/500 mg，容積6 mL，北京迪科馬科技有限公司；

氟羅里硅土(Florisil)固相萃取柱：500 mg/6 mL，美國Waters公司。

1.3 樣品前處理

(1) 油菜：精準稱量5.00 g已粉碎均勻的油菜，加入20 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取2 min，加入5～7 g氯化鈉，多次快速振蕩，8 000 r/min離心3 min，取上清移，加入10 mL乙腈，重復2次提取，準確移取上清液10 mL，于40 ℃水浴中氮氣吹至近干，加入3 mL乙腈—甲苯溶液(V乙腈∶V甲苯為3∶1)，待凈化。

(2) 油菜籽：精準稱量5.00 g已粉碎均勻的油菜籽，加入10 mL乙腈—正己烷溶液的上層液體，渦旋振蕩，靜置30 min，準確加入20 mL乙腈—正己烷溶液的下層液體，15 000 r/min 勻漿提取2 min，去除正己烷層，加入5～7 g 氯化鈉，劇烈振蕩，8 000 r/min離心3 min，取上清移，加入10 mL正己烷飽和的乙腈溶液，重復提取2次，準確移取上清液10 mL，于40 ℃水浴中氮氣吹至近干，加入3 mL乙腈—甲苯溶液(V乙腈∶V甲苯為3∶1)，待凈化。

(3) 凈化：用5 mL乙腈—甲苯溶液預淋洗石墨化碳黑—氨基復合柱，棄去淋洗液。將待凈化液洗滌入固相萃取柱內，通過3 mL的乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯為3∶1)溶液洗滌，重復3次。于40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL 乙腈—水溶液(V乙腈∶V水為1∶1)復溶，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 LC-MS分析條件

1.4.1 液相色譜 色譜柱為Poroshell 120 C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，流動相A為乙腈，流動相B為2.0 mmol/L 乙酸銨—0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min，進樣體積5 μL，柱溫40 ℃，按表1進行梯度洗脫。

表1 流動相洗脫條件Table 1 The mobile phase elution conditions

1.4.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量5.1 L/min，霧化器壓力2.4×107Pa，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速11.0 L/min，毛細管電壓4 000 V，噴嘴電壓1 100 V，正離子掃描模式，母離子和子離子質譜參數見表2。

表2 草除靈的母離子和子離子質譜參數?Table 2 Themass spectrometry parameters of the precursor ion and product ion of benazolin

1.5 試驗方法

1.5.1 標準曲線繪制 精準稱量標準品草除靈，甲醇定容，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準貯備液。移取1 mL 標準貯備液，甲醇定容，配成質量濃度分別為100.0，10.0，1.0，0.1 μg/mL的標準中間液，用空白基質分別配制0.025，0.050，0.100，0.500，1.000，2.000 μg/mL的草除靈標準溶液，并繪制標準工作曲線。

1.5.2 提取溶劑的選擇 選取乙腈(或正己烷飽和的乙腈)、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷4種不同極性的提取試劑，空白基質中加入草除靈標準溶液，測其回收率。

1.5.3 固相萃取柱(SPE小柱)的選擇 選擇石墨化炭黑/氨基(GCB/NH2)復合SPE小柱和弗羅里硅土柱進行對比，將草除靈標準溶液加入到空白基質中，轉移全部待凈化液至固相萃取柱凈化，經儀器測定，計算加標回收率。

1.5.4 復溶溶劑的選擇 取適量草除靈標準工作液于離心管中，氮氣吹干，分別加入乙腈、水、甲醇、乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)、甲醇+水(V甲醇∶V水為1∶1)5種復溶標準工作液，經0.22 μm有機濾膜過濾，待測。

1.5.5 基質效應評價 取適量草除靈標準農藥貯備液，分別使用乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)和空白基質樣品處理液進行定容，對相同質量濃度的工作液進行測定[13]。

1.5.6 空白基質的加標回收試驗 油菜和油菜籽兩種空白基質中分別添加0.03，0.06，0.15 mg/kg 3個水平的標準溶液進行回收率測定，各水平重復6次。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的選擇

根據草除靈標準物質的回收率可知，乙腈(或正己烷飽和的乙腈)、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷均能高效提取草除靈，其回收率均在80%以上。其中丙酮與基質中的水互溶，難以進一步用固相萃取柱凈化；乙酸乙酯和二氯甲烷在提取草除靈的同時，也提取出基質中的脂肪、蛋白、色素等雜質。對于基質油菜籽，以正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑時，乙腈能提取出溶于正己烷中的草除靈，正己烷又能去除乙腈中的脂類雜質，有利于進一步凈化。

2.2 凈化小柱的選擇

由圖1～圖3可知，對于雜質、色素，Florisil柱的吸附能力較低，對草除靈目標物的響應干擾較大，且回收率為75%左右，而GCB/NH2柱帶有芳香性正六元環結構，具有高凈化效果，能有效吸附色素和雜質，近乎去除基質中90%的雜質，其獨特的選擇性能高效地將草除靈從雜質中洗脫出來，回收率為85%左右。因此，選擇GCB/NH2柱作為凈化柱。

圖1 草除靈標準工作液譜圖Figure 1 Benazolin standard working solution spectrum

圖2 經Florisil固相萃取柱凈化的草除靈標準譜圖Figure 2 Standard spectra of benazolin after purification by florisil solid-phase extraction column

圖3 經GCB/NH2固相萃取柱凈化的草除靈標準圖譜Figure 3 Standard spectra of benazolin after purification by GCB/NH2 solid phase extraction column

2.3 復溶溶劑的選擇

由圖4可知，選擇單一的甲醇和乙腈作復溶溶劑回收率為70%左右，選擇水作為復溶溶劑回收率僅60%。而使用混合溶劑乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)和甲醇+水(V甲醇∶V水為1∶1)的回收率相對較高。從極性角度考慮，水的極性大于甲醇，甲醇的極性大于乙腈，而草除靈是非極性物質，應選擇乙腈作復溶試劑，乙腈中加入適量水可大大提高復溶試劑的極性，更利于油脂基質中草除靈的提取，所以選擇乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)作復溶溶劑。

圖4 復溶溶劑對回收率的影響Figure 4 Effect of resolution solvent on recovery rate

2.4 基質效應

由表3可知，油菜和油菜籽基質中的草除靈離子化效率低于乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)溶液中的，其基質效應為73%左右[13]，說明基質對草除靈有抑制作用。對于陽性樣品而言，采用對應的空白基質配制標準曲線，草除靈離子化效率接近，可避免基質效應帶來的試驗結果偏離，從而提高陽性樣品數據測定的準確性。

表3 草除靈的基質效應Table 3 The matrix effect of benazolin

2.5 檢出限、定量限、線性關系、準確度及精密度

2.5.1 線性關系 用草除靈標準中間液配制標準曲線，其線性方程為Y=3 085.8X-16 881(R2=0.999)，相關性良好。

2.5.2 檢出限與定量限 試驗測得LC-MS方法的檢出限為0.008 mg/kg，定量限為0.027 mg/kg。

2.5.3 準確度與精密度 由表4可知，在0.03，0.06， 0.15 mg/kg 添加水平下，油菜基質中草除靈的平均回收率為86.3%～91.3%，相對標準偏差(RSD)為4.4%～6.7%；油菜籽基質中草除靈的平均回收率為73.3%～84.2%，RSD為7.3%～8.7%。

表4 草除靈回收率和相對標準偏差Table 4 The recovery rate and relative standard deviation of benazolin

3 結論

建立了一種適合油菜和油菜籽中草除靈的檢測方法。結果表明，以乙腈作為提取溶劑，石墨化炭黑—氨基復合柱凈化，C18柱分離，采用高效液相色譜—串聯質譜法進行測定，該方法的前處理方便快捷、凈化完全、高效簡便，且能夠得到較低的檢出限和較高的回收率，并能滿足日常檢測需求。有關其他類似基質中草除靈殘留量的檢測有待進一步探究。