豇豆中啶蟲脒基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

劉 燕 殷柯柯 李 博 龐 泉 楊亞琴

(1. 河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，河南 鄭州 450047;2. 河南省計量科學(xué)研究院，河南 鄭州 450047;3. 天津市食品安全檢測技術(shù)研究院，天津 300000;4. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450003)

啶蟲脒(acetamiprid)又名乙蟲脒、吡蟲清，屬于氯化煙堿類化合物，現(xiàn)常作為氨基甲酸酯、有機磷類農(nóng)藥替代品用于農(nóng)業(yè)病蟲害的控制[1]。2020—2021年，廣東[2]、上海[3]、福州[4]、海南等地農(nóng)產(chǎn)品市場監(jiān)督抽檢中不斷有啶蟲脒超標(biāo)出現(xiàn)，實驗室農(nóng)產(chǎn)品日常監(jiān)測工作中豇豆中啶蟲脒檢出率也較高。豇豆是花果同期作物，菜農(nóng)在豇豆收獲期施用農(nóng)藥控制花期病蟲害容易導(dǎo)致農(nóng)藥安全間隔期無法保證，造成農(nóng)殘超標(biāo)。啶蟲脒是廣譜高效殺蟲劑[5],當(dāng)被大劑量施用于農(nóng)作物時也會造成農(nóng)殘超標(biāo)。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[6-8]是具有實際樣品特性并具有足夠均勻性和穩(wěn)定性特性值的物質(zhì)或者材料，由于其目標(biāo)化合物比基體更接近真實檢測樣品，能有效降低檢測過程中的基體效應(yīng)，保障檢測結(jié)果準(zhǔn)確性[9-19]，被廣泛應(yīng)用于實驗室質(zhì)量控制工作。截至2021年，中國基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有36種，涉及水、土壤、水產(chǎn)、污水污泥、茶葉、濃縮蘋果汁等類別。然而果蔬農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)水分含量高、易腐爛變質(zhì)，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)常規(guī)制備以液體、果蔬漿添加穩(wěn)定劑、增稠劑、防腐劑為主，技術(shù)成本高、穩(wěn)定性不易保持，而且成品不方便貯藏運輸。傳統(tǒng)高溫烘干、噴霧干燥工藝制備的樣品復(fù)溶品質(zhì)差、農(nóng)殘?zhí)砑游镆追纸狻＠鋬龈稍锛夹g(shù)[20-21]生產(chǎn)的果蔬凍干粉能克服以上工藝技術(shù)缺陷，采用該技術(shù)制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)復(fù)水性好，復(fù)溶后的產(chǎn)品能極大程度保留原產(chǎn)品特性并且水分含量易于控制，方便貯藏和運輸，且均勻性和穩(wěn)定性良好。研究擬以豇豆為基體，制備啶蟲脒豇豆基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，旨在為加強農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制、評估農(nóng)殘膳食風(fēng)險水平、制修訂食品安全標(biāo)準(zhǔn)工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆：無農(nóng)藥噴灑，農(nóng)科院有機試驗田；

農(nóng)藥啶蟲脒溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)081861：標(biāo)準(zhǔn)值1 000.0 μg/mL，擴展不確定度9 μg/mL (k=2)，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢測中心；

甲醇、乙腈：色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司；

丙酮：色譜純，煙臺市雙雙化工有限公司；

甲酸、乙酸銨：色譜級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

陶瓷均質(zhì)子(Agilent5982-9313)、萃取鹽提取包(Agilent Bond Elut EN5982-5650)、吸附劑硫酸鎂凈化管(Agilent5982-5056)：安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters TQS型，美國Waters公司；

冷凍干燥機：SCIENTZ-12ND型，寧波新芝公司；

電子分析天平：XA205DV型，瑞士Mettler Toledo公司；

渦旋混合器：IKA MS3型，德國IKA公司；

冷凍離心機：CT 14RD TECHCOMP型，北京天美科學(xué)儀器有限公司；

24位氮吹儀：DC-24型,上海安普實驗科技股份有限公司；

打碎磨粉機：800Y型，中國永康市鉑歐五金制品有限公司；

去離子水發(fā)生器：Milli-Q型，美國Millipore公司；

三維混合機：SYH-1型，江蘇天力干燥工程有限公司；

鈷源工業(yè)輻射裝置：Co60，河南省科學(xué)院同位素研究所輻照中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備 取空白陰性豇豆樣品25 kg粉碎至軟糊狀，放入凍干機托盤預(yù)冷凍后凍干處理。出倉打粉過40目篩，得到空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。取2 L大燒杯，將設(shè)計量的啶蟲脒農(nóng)藥用丙酮稀釋至一定體積，分3次倒入裝有2.0 kg空白基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的大燒杯中不斷攪拌，液體沒過空白基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，繼續(xù)攪拌3 min，加玻璃表面皿放置于通風(fēng)櫥內(nèi)等待溶劑自然揮發(fā)至接近物料上表面。將物料于真空度0.001 Pa下凍干48 h，粉碎過40目篩，于溫度20 ℃、濕度35%下低速混勻36 h，水分保持在5%以下。混勻的樣品由檢驗員在干燥倉內(nèi)手動分裝至5 mL螺旋口棕色儲液瓶，并裝入鋁箔袋抽真空封口包裝，每單元5 g/瓶。集中采用鈷源工業(yè)輻射裝置輻照處理，輻照劑量11 kGy，輻照時間1 h，于超低溫冰箱貯藏備用。

1.3.2 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)啶蟲脒含量測定 根據(jù)文獻[22-23]并修改。

(1) 樣品處理：稱取1.000 g樣品(精確至0.001 g)于50 mL塑料離心管中，加入9 mL超純水渦旋混勻使其復(fù)溶，靜置20 min。參照GB 23200.121—2021中的QuEChERS前處理方法進行提取和凈化。繼續(xù)加入10 mL 乙腈、陶瓷均質(zhì)子劇烈振蕩1 min，加入萃取鹽包繼續(xù)劇烈振蕩1 min，4 ℃、5 000 r/min離心5 min，取6 mL 上清液加入含有凈化吸附劑和硫酸鎂的15 mL凈化管中渦旋混勻1 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液過Captiva RC有機濾膜，上LC-MS/MS測試，采用基體標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量檢測。以1.000 g陰性樣品(精確至0.001 g)為對照，得空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(2) 液相色譜條件：色譜柱為HSS T3 2.1 mm×100 mm×1.8 μm；流動相A為5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸；流動相B為乙腈；流速0.3 mL/min；色譜柱溫度40 ℃；進樣量2 μL，按表1進行梯度洗脫。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Tabe l Conditions of gradient elutionin HPLC

(3) 質(zhì)譜條件：電離模式為ESI+；多反應(yīng)MRM監(jiān)測；去溶劑溫度500 ℃，去溶劑氣流速1 000 L/Hr，霧化氣壓力0.7 MPa，離子源溫度150 ℃，氣簾流速150 L/Hr，毛細管電壓2.5 kV，錐孔電壓30 V；啶蟲脒多反應(yīng)監(jiān)測母離子(m/z)223，定量子離子(m/z)126，定性子離子(m/z)99。

1.3.3 方法學(xué)驗證 稱取1.000 g陰性樣品(精確至0.001 g)于50 mL塑料離心管中，精密加入適量啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其含量約為0.25，0.50 mg/kg，混勻后按1.3.2中樣品處理方法制得樣品加標(biāo)回收測定液，供LC-MS/MS上機測試。

1.3.4 均勻性檢驗 按JJF 1343—2012執(zhí)行。采用單因素方差分析(F檢驗)對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析[24]。

1.3.5 穩(wěn)定性檢驗 按JJF 1343—2012執(zhí)行，采用同步穩(wěn)定性評估方法以減少評估各時間點測量結(jié)果的離散型。考察-18 ℃貯藏條件下的長期穩(wěn)定性和30 ℃?zhèn)鬟f過程的短期穩(wěn)定性。

(1) 長期穩(wěn)定性：隨機抽樣，采用先密后疏的原則選取時間間隔為0，1，3，6，12，24周，每個時間點抽取3個樣品，每個樣品平行測定3次，并采用線性擬合方程模型進行統(tǒng)計分析。

(2) 短期穩(wěn)定性：采用t檢驗法，選取時間間隔為0，1，2，4，7 d，每個時間點抽取3個樣品，每個樣品平行測定3次取平均值。

1.3.6 合作定值 采用9家通過資質(zhì)認定的具有技術(shù)權(quán)威性的檢驗檢測機構(gòu)作為合作定值實驗室，編號分別為1～9，每個實驗室3個樣品，每個樣品平行測定3次，通過Grubbs和Cochran檢驗進行數(shù)據(jù)處理，剔除離可疑值和離群值，將剩余的數(shù)據(jù)取總平均值作為制備基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值。

(1) 格拉布斯(Grubbs)檢驗：按式(1)、式(2)對9家合作定值實驗室內(nèi)檢測數(shù)據(jù)是否有顯著差異進行驗證評估。

Umin<λ(0.05,9)×s，

(1)

Umax<λ(0.05,9)×s，

(2)

式中：

Umin——各實驗室內(nèi)檢測結(jié)果最小值與平均值的差值的絕對值；

Umax——各實驗室內(nèi)檢測結(jié)果最大值與平均值的差值的絕對值；

s——各實驗室內(nèi)檢測數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

查λ(0.05,9)=2.215，如果式(1)、式(2)同時成立，說明該實驗室內(nèi)數(shù)據(jù)無離群值。否則剔除離群值，并重新進行Grubbs檢驗直至最后剩余的數(shù)據(jù)均能通過該檢驗。

(2) 科克倫(Cochran)檢驗：按式(3)對9家合作定值實驗室測定結(jié)果平均值是否等精度進行驗證評估。

(3)

式中：

如果CC(0.05,9,9)，需剔除該合作定值機構(gòu)離群值重新進行檢驗，直至數(shù)據(jù)通過Cochran檢驗。

(3) 參與定值設(shè)備及規(guī)格型號：見表2。

表2 儀器品牌和型號Tabe 2 Instrument brand and model

1.3.7 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評估 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)統(tǒng)計方法指南[25]規(guī)定，評估合作定值方法得到定值結(jié)果的不確定度，考察均勻性、穩(wěn)定性、合作定值測定和B類不確定度共同的貢獻。

(1) 均勻性標(biāo)準(zhǔn)不確定度ubb評估：通過F法檢驗均勻性良好的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)考察均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

(4)

式中：

S1——組間標(biāo)準(zhǔn)偏差；

S2——組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(2) 穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)不確定度us評估：采用趨勢分析法，考察線性關(guān)系斜率隨樣品穩(wěn)定性變化的變化值。該研究考察了長期穩(wěn)定性引入的不確定度ults和短期穩(wěn)定性引入的不確定度usts，穩(wěn)定性不確定度按式(5)計算。

us=s(β1)×d，

(5)

式中：

ults——長期穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

usts——短期穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

s(β1)——β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

d——保存期限。

(3) 合作定值測定引入A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucharA評估：由9家檢驗檢測機構(gòu)采用同種方法對生產(chǎn)的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，參與機構(gòu)檢測數(shù)據(jù)的總平均值作為特性值，合作定值測定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(6)計算。

(6)

式中：

S——各檢驗檢測機構(gòu)定值結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

m——合作定值機構(gòu)數(shù)量。

(4) 合作定值引入B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucharB評估：包含樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelB1、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelB2、體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelB3、實驗室溫度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelB4和溶液移取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelB5。

(7)

ucharB=urelB×x。

(8)

(5) 合成擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度：上述各不確定度分量合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uCRM，乘以包含因子k，即為基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴展不確定度UCRM。

(9)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

通過添加不同含量水平的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定其加標(biāo)回收率，由表3可知，回收率為99.5%～105.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<2%，驗證結(jié)果滿足定值要求。

2.2 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗

隨機從封裝好的單元中抽取15個樣品進行均勻性檢測，每個樣品測定3次，結(jié)果見表4。檢驗結(jié)果采用單因素方差分析法(F檢驗法)進行統(tǒng)計分析，F(xiàn)

表4 均勻性統(tǒng)計結(jié)果?Table 4 Statistical analysis results of homogeneity testing

2.3 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗

2.3.1 短期穩(wěn)定性 由表5可知，|β1|

表5 短期穩(wěn)定性結(jié)果統(tǒng)計?Table 5 Statistical analysis results of short-term stability testing

2.3.2 長期穩(wěn)定性 由表6可知，|β1|

表6 長期穩(wěn)定性結(jié)果統(tǒng)計?Table 6 Statistical analysis results of long-term stability testing

2.4 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合作定值

對9家檢驗檢測機構(gòu)的測量數(shù)據(jù)首先采用Grubbs檢驗，查表得λ(0.05,9)= 2.215，考察各家實驗室內(nèi)檢測數(shù)據(jù)的最小值殘差Umin<λ(0.05,9)×s和最大值殘差Umax<λ(0.05,9)×s，經(jīng)過考察9家檢驗檢測機構(gòu)數(shù)據(jù)均通過Grubbs檢驗。繼續(xù)采用科克倫法檢驗各家實驗室平均值間是否等精度，查表得C(0.05,9,9)=0.266，計算得出C=0.263 7并且滿足C

表7 9家實驗室合作定值結(jié)果?Table 7 Cooprative fixed value of 9 laboratories

2.5 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評估

3 結(jié)論

通過凍干技術(shù)、樣品外源加標(biāo)、Co60輻照滅菌相結(jié)合工藝，采用液相色譜—質(zhì)譜串聯(lián)法檢測、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正定量以及多家實驗室合作定值的方式建立了一種豇豆中啶蟲脒基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。結(jié)果表明，該方法工藝簡單，易于生產(chǎn)控制，制備的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)極大程度保留了基質(zhì)樣品本底特征，樣品復(fù)原性、均勻性、穩(wěn)定性均良好，通過9家實驗室合作定值最終確定特性值為(0.283 7±0.008 5) mg/kg (k=2)。制備的產(chǎn)品可用于檢測設(shè)備期間核查、新方法確認與驗證、實驗室間組織比對等實驗室質(zhì)量管理工作。

鑒于農(nóng)殘多殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有著更廣泛的應(yīng)用面，且考慮市場實際需求該研究同時進行了以豇豆為基體的啶蟲脒、嘧菌酯、氯蟲苯甲酰胺和噻蟲嗪多殘留協(xié)同研究。穩(wěn)定性保持和精準(zhǔn)定值是多殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的關(guān)鍵控制點，但該研究多殘留穩(wěn)定性控制尚未達到目標(biāo)物協(xié)同正相關(guān)預(yù)期，下一步將繼續(xù)加強多殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保存工藝研究。農(nóng)產(chǎn)品基體種類繁多，農(nóng)殘問題復(fù)雜，市場需求量大，農(nóng)殘基體標(biāo)物設(shè)計上應(yīng)以市場急需和突發(fā)情況為主，同時拓寬特性量值種類，提升定值技術(shù)水平。