腦肌酸激酶/磷酸肌酸系統與中樞認知功能的機制綜述

張涵濤，朱 朱，李瑞梅，徐淑怡，陳飛燕，戴建國，陳 琳，趙玉男

南京中醫藥大學 醫學院 整合醫學學院，江蘇南京 210023

肌酸激酶(creatine kinase，CK)又稱肌酸磷酸轉移酶，是由兩個相同的或極其相近的亞基組成的二聚體酶，包括肌肉型、腦型、雜化型和線粒體型同工酶。CK主要存在于細胞質和線粒體中，是一種與細胞內能量運轉、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)再生有直接關系的重要激酶，其與磷酸肌酸(creatine phosphate，PCr)形成了能量緩沖系統。大腦中的CK/PCr系統主要包括兩種CK同工酶——胞質腦型CK(brain-type creatine kinase，B-CK)和普遍存在的線粒體CK(ubiquitous mitochondrial creatine kinase，uMtCK)[1]。神經系統所需要的大部分能量也是由線粒體以ATP的形式提供，腦CK/PCr能量緩沖系統在神經細胞復雜的代謝和能量轉移網絡中發揮著重要作用。認知功能是大腦的主要功能之一，受腦內微環境、神經細胞的數量和結構、突觸形態、腦內能量水平等因素影響[2]。認知功能障礙常伴有腦能量代謝的紊亂，提示腦CK/PCr系統的異常可能與認知功能障礙有著密切的聯系。本文對近年來相關的研究進行綜述，以闡明腦CK/PCr系統與中樞神經系統認知功能障礙的病理生理機制，并為以肌酸(creatine，Cr)或CK為靶點開發新藥提供一定的參考。

1 肌酸激酶/磷酸肌酸能量緩沖系統

CK與PCr形成一個重要的能量緩沖系統(圖1)：該系統參與轉運高能磷酸化合物，把 ATP 從產能區運至需能區，發揮空間上的緩沖作用；同時，在能量需求高或波動較大的細胞充當能量池，發揮時間上的緩沖作用；此外，CK的存在使 PCr 的高能磷酰基能快速轉移到二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)生成ATP，加快ATP的生成速度，增加了能量釋放的爆發力，維持一個相對較高的ATP/ADP比例，使細胞在機體有高能量需求時仍能發揮正常功能[3-4]。

圖1 腦肌酸激酶/磷酸肌酸能量緩沖系統[4]

在腦中，B-CK和uMtCK都有特定的功能。uMtCK利用線粒體內ATP，將其高能磷酸鍵轉移至Cr，形成PCr輸出到胞質。在高能量需求時，B-CK利用胞質PCr的能量儲備，將ADP轉化為ATP供能；而在需求降低時，B-CK又將多余的ATP轉化為PCr進行儲能，并且在這個過程中多余的Cr也被重新輸送回線粒體，在uMtCK的作用下重新轉化為PCr[5]。

2 肌酸對認知功能的影響

Cr參與細胞能量的傳遞、運輸和調節，并且以非依賴氧氣的方式補充細胞內的ATP[6]。近年來大量研究顯示，Cr增補可提高運動員對高強度運動的適應力并促進運動損傷的恢復[7–9]。鑒于Cr在缺氧致神經元損傷時仍具有神經保護作用以及中樞神經系統的高代謝需求特性，通過Cr增補改善認知功能已成為研究熱點之一。

2.1 肌酸缺乏與認知功能障礙 在脊椎動物中，Cr可通過飲食和內源性合成獲得，進入血液循環后被高能量需求的靶組織吸收[10]。相比于其他組織器官，腦組織中Cr的合成和攝取更為復雜，可分為以下四種不同細胞亞群[11]：1)含有Cr合成途徑的兩種酶，甘氨酸酰胺轉移酶(arginineglycine aminidino transferase，AGAT)和胍基乙酸甲基轉移酶(guanidinoacetate methyl transferase，GAMT)；2)只有AGAT或GAMT，需要Cr轉運體(creatine transporter，CrT) SLC6A8協助；3)不含有任何合成酶，并且絕對依賴于CrT來吸收其他細胞產生的Cr；4)沒有任何合成酶或轉運體，也不使用Cr。

AGAT和GAMT缺乏癥患者因腦Cr合成障礙、腦內Cr水平降低，表現出發育遲緩、智力遲鈍和語言障礙等認知功能損傷，且GAMT缺乏癥患者的臨床表現較AGAT缺乏者更加嚴重，這是由于缺乏GAMT會增加神經毒醋酸胍的積累[12-13]。

CrT起著將Cr從血液循環分配到組織中的作用，CrT的突變使細胞攝取Cr的能力喪失[14]。Hautman等[15]發現CrT+/-雌性小鼠的腦Cr水平降低，在Morris水迷宮實驗中，登臺潛伏期和尋找隱藏平臺時間延長，提示CrT+/-雌性小鼠存在一定的空間學習和記憶缺陷；Baroncelli等[16]發現在新物體識別實驗中，腦特異性CrT基因敲除的雄性小鼠對熟悉物體的記憶能力下降，并隨年齡增加而逐漸加重。臨床研究也發現CrT缺乏癥患者存在注意力減退、語言功能損傷等認知功能障礙的臨床表現[17]。CrT功能受損導致中樞神經系統認知功能障礙的機制可能如下：腦內Cr水平明顯降低，使海馬CA1區域神經元突觸相關蛋白數量顯著減少，且打破γ－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和Tau蛋白的穩態，出現學習記憶能力受損和認知功能障礙[18-20]。

2.2 肌酸增補與認知功能改善 Turner等[6]發現通過補充Cr增加神經系統Cr的水平，可提高缺氧時促腎上腺皮質激素的興奮性，緩解嚴重缺氧引起注意力下降的程度。此外，絕經后的女性補充Cr可以改善其認知功能[20]。Shen和Goldberg[21]發現體外補充Cr可延緩低氧誘導的神經元膜的去極化，有利于維持神經元結構和功能的完整性。Mao等[22]研究顯示，補充Cr可以激活mTORC1信號(mTORC1信號通路在學習記憶的過程中發揮著關鍵作用)和增加齒狀回突觸后蛋白PSD-95，進一步改善大鼠脂多糖誘導的空間記憶和識別記憶障礙。

大量研究顯示，補充Cr對神經退行性疾病有一定的改善作用。1)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)：Brewer和Wallimann[23]發現在無血清培養的神經元中，補充Cr可減輕谷氨酸及β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積對海馬神經元的毒性，其中谷氨酸積累和Aβ沉積會嚴重影響認知功能。在AD模型小鼠中，補充Cr增加了環磷腺苷效應元件結合蛋白的磷酸化(在學習和記憶過程中起著重要作用[24])并提高了NF-κB抑制劑(NF-κB與學習記憶和突觸功能密切相關)、CaMKⅡ(長期記憶形成所需的蛋白質)和PSD-95的表達水平，并減少了Aβ的沉積；在行為學上，補充Cr后小鼠水迷宮實驗中，登臺潛伏期明顯縮短，提示補充Cr可以改善小鼠空間記憶能力[4]。2)亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)：HD是一種全外顯性的常染色體顯性遺傳病，其致病基因Huntingtin表達Huntingtin蛋白致神經退行性病變，主要表現在運動性神經元的病變，其次是認知障礙。補充Cr給予細胞能量支持，改善神經元的形態和功能，為治療HD提供可行性方案[25]。3)抑郁癥：Pazini等[26]發現Cr增補可以逆轉皮質酮抑郁模型小鼠的海馬背側區和腹側區神經元分化異常，并在一定程度上改善小鼠的情緒和認知功能。4)多發性硬化癥(multiple sclerosis，MS)：MS以脫髓鞘、突觸病變和神經變性為特征[27]。中樞神經系統脫髓鞘疾病普遍存在著認知功能受損[28]。有研究顯示在脫髓鞘疾病中，增加髓鞘的再形成，可以明顯改善小鼠的空間記憶能力，而補充Cr有助于增強少突膠質細胞的線粒體功能并促進少突膠質細胞的存活，從而促進MS的髓鞘再形成，就這暗示了補充Cr治療MS的可行性[29-30]。

3 肌酸激酶對認知功能的影響

在野生型小鼠的大腦中，B-CK在海馬、皮質層深處、小腦顆粒細胞層中有較高的表達水平。早在20世紀60年代有研究發現uMtCK通常與B-CK共表達，這兩種CK亞型均高表達于小腦顆粒層細胞、脈絡膜叢、海馬顆粒和錐體細胞中[31]。神經元需要大量ATP來維持膜的極化、細胞器中的Ca2+內流、神經遞質的加工、細胞內信號系統的運行、軸突和樹突運輸，B-CK和uMtCK與這些重要過程密切相關。在亞細胞水平上，B-CK還與突觸囊泡和突觸質膜結構功能的維持有關。

Jost等[32]發現B-CK基因敲除的小鼠在海馬苔蘚纖維連接的形成和維持，以及習慣化、空間學習和癲癇易感性等行為方面表現出明顯異常，揭示了B-CK在認知功能中的重要作用；Streijger等[33]對缺乏B-CK和uMtCK基因表達的成年小鼠(CK雙敲除小鼠)進行形態學分析，發現CK雙敲除小鼠大腦質量減少和海馬體積縮小，行為學分析顯示該種小鼠空間學習能力嚴重受損，并表現出較低的筑巢活動和聲震反射反應，這些結果表明缺乏B-CK和(或)uMtCK，降低了成年小鼠大腦的突觸回路應對認知活動相關挑戰的效率。Briones等[34]發現創傷性腦損傷患者B-CK水平降低，而絕大多數創傷性腦損傷患者存在著認知功能障礙。另外，uMtCK與腦源性神經營養因子協同調節海馬的學習記憶功能，腦源性神經營養因子在突觸可塑性維持過程中發揮重要作用，與學習記憶密切相關[35-36]。以上研究都直接或間接提示了缺乏B-CK和(或)uMtCK可能會影響認知功能。

4 肌酸激酶與神經退行性疾病

神經退行性疾病是由神經元和(或)其髓鞘的喪失所致，以行為、運動和認知功能障礙為主要特征。B-CK活性降低是神經退行性疾病中神經元損傷的標志之一。以下是幾種伴有CK異常的神經退行性疾病。

4.1 阿爾茨海默病 蛋白質組學研究顯示，B-CK是AD腦內特異性氧化蛋白之一，AD患者腦組織中B-CK的活性明顯降低，意味著AD患者腦中穩定的細胞能量狀態受到干擾，膠質細胞、神經元和突觸的能量供應也會發生改變[37]。Hernández等[38]發現Tau蛋白與B-CK結合可以穩定腦能量代謝，在軸突運輸過程中起著關鍵作用，而AD患者的腦內B-CK被氧化，Tau蛋白無法與B-CK結合，從而使AD患者腦內神經功能受損，學習記憶相關認知功能出現障礙。Fahanik-Babaei等[39]發現給予AD模型大鼠葫蘆巴堿可以減輕海馬CA1區域的神經元死亡、改變氧化應激相關反應、改善空間記憶和物體識別等相關認知功能。Farid等[40]進一步發現B-CK是葫蘆巴堿的直接結合靶點，葫蘆巴堿可以穿透血腦屏障進入大腦，結合并激活B-CK，從而促進神經元軸突和樹突的生長，改善AD模型小鼠的認知功能，反之使用B-CK抑制劑會拮抗葫蘆巴堿誘導的軸突和樹突的生長。

4.2 亨廷頓舞蹈病 GABA信號轉導中斷被認為參與了HD發病的過程，GABA能神經元的功能在很大程度上取決于跨膜氯化物的濃度梯度，其主要受Na+-K+-2Cl-聯合轉運體和氯化鉀協同轉運蛋白-2的控制，而Na+-K+-2Cl-聯合轉運體和氯化鉀協同轉運蛋白-2的活性受到B-CK的調控[41]。Ju等[42]發現能量失調是HD的一個重要致病因素，包括B-CK在內的三個關鍵分子與HD發病過程密切相關。Lin等[43]發現突變的Huntingtin基因抑制了B-CK基因啟動子的功能，使得HD小鼠腦內B-CK表達水平顯著降低，引起神經突起萎縮等病理改變，從而導致與HD相關的神經元功能障礙，而內源性增加B-CK的表達或膳食補充Cr可明顯逆轉上述病變，這提示了B-CK在HD發病過程中的重要地位。

4.3 多發性硬化癥 認知障礙是MS患者最常見的癥狀之一，可發生在疾病的任何一個階段[44]。MS患者體內B-CK水平降低，導致了大腦白質中的PCr代謝障礙，使谷氨酸毒性增加，一方面腦白質與認知功能密切相關，另一方面谷氨酸毒性積累會導致少突膠質細胞的胞體和軸突退化，進一步影響認知功能[45-46]。Shen等[47]發現B-CK具有維持信號快速轉導的作用，還發現了B-CK與髓鞘蛋白同時表達，表明B-CK可能與髓鞘化有著某種聯系。Wang等[48]發現 2-( 2-苯并呋喃酰基)2-咪唑啉在大腦中大量表達，與B-CK結合具有較高的特異性，使用2-( 2-苯并呋喃酰基)2-咪唑啉治療MS模型小鼠，可以增強B-CK和CaATP酶的活性并降低鈣蛋白酶的活性，以保護損傷的神經元。

4.4 其他神經退行性疾病 在皮克病[49]、雷特綜合征[50]、彌漫性路易體疾病[51]和雙相情感障礙[52]等其他神經退行性疾病中，B-CK的活性和(或)含量均存在不同程度的降低。Xu等[53]發現PD患者體內uMtCK水平顯著降低，uMtCK活性與帕金森綜合征的進展過程呈正相關。

在上述神經退行性疾病中，CK活性和(或)含量的變化均有不同程度的下降，其引起認知功能障礙的機制主要涉及對神經元樹突和軸突的形態、突觸的可塑性、細胞內信號系統的運行、神經纖維髓鞘化、氧化應激反應和谷氨酸的積累的影響，藥物激活CK或內源性增加CK可以明顯改善動物的認知功能，這提示以CK為靶點探索改善認知功能障礙藥物的可行性，為藥物研發提供了新的思路。

5 腦型肌酸激酶和線粒體肌酸激酶的區別和聯系

Lenz等[54]用si-RNA沉默細胞內B-CK和uMtCK基因的表達，發現相比于沉默B-CK基因，沉默uMtCK基因后線粒體的超微結構發生顯著變化，這一研究證實了uMtCK在維持內膜的ATP- ADP偶合交換和穩定線粒體內外膜方面的具體作用，提示了uMtCK不僅參與了能量緩沖系統，還保護了線粒體的結構和功能。

有研究對B-CK-/-、uMtCK-/-和雙敲除的CK-/-小鼠進行實驗，發現與野生型相比，腦PCr水平在B-CK-/-或uMtCK-/-小鼠中無顯著變化，而在CK-/-小鼠中明顯降低，提示B-CK和uMtCK在PCr代謝上的協同效應[55]。此外，與野生型相比，uMtCK-/-小鼠有較高的谷氨酸水平，B-CK-/-小鼠的總N-乙酰天冬氨酸(NAA)和肌醇水平較低，這提示 uMtCK對認知功能的影響可能與促進谷氨酸的清除有關，而B-CK的作用可能與維持神經元結構/功能完整性、抗神經炎癥有關[56-58]。

Meyer等[57]發現uMtCK可以減少丙酮酸氧化，減少活性氧的形成，且發現Cr有抗氧化的作用，但Cr抗氧化作用的發揮是需要激活uMtCK介導的，當uMtCK功能缺失時，胞質型CK可以補償這種缺失，以確保維持Cr磷酸化和ADP的產生。這提示uMtCK可以調節氧化應激反應，但在神經退行性疾病中檢測B-CK水平可能更加有意義。

B-CK和uMtCK在大腦的分布和對認知功能影響的機制上有許多共同之處，也有一定的區別。見表1。

表1 腦內腦型肌酸激酶和線粒體肌酸激酶的區別和聯系

6 結語

大量研究提示腦CK/PCr系統對認知功能有明顯影響，其機制主要涉及線粒體功能和細胞能量代謝，而且B-CK和uMtCK可能存在某種協同效應。相比而言，B-CK在保持神經元軸突和樹突的正常形態、維持神經元結構和功能的完整性上發揮著更重要的作用，而uMtCK可能更偏向于影響線粒體的超微結構。

隨著社會的高速發展與人口老齡化的加劇，神經退行性疾病的發病率居高不下，越來越多的老年人面臨認知功能障礙的風險，因此，尋找能有效預防或治療認知功能障礙的藥物迫在眉睫。既往大量研究表明CK/PCr能量緩沖系統的激活與認知功能障礙的改善密切相關，這豐富了對認知功能障礙病理生理機制的認識，也提示以Cr或CK為靶點探索改善認知功能障礙藥物的可行性，為藥物研發提供新的思路。