Tuftsin衍生物T肽的抗腫瘤作用及機制探討

史振偉，羅 東，孫 琦，王聰聰，楊 齊，馬 玥，楊 飛，黃轉青，徐風華

1 解放軍總醫院醫療保障中心 藥劑科藥學基礎研究室，北京 100853；2 解放軍醫學院，北京 100853

黑色素瘤是一類起源于黑色素細胞的高度惡性腫瘤，發生于皮膚、黏膜、眼葡萄膜、軟腦膜等部位[1]。它是臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，具有高度惡性、高侵襲性、易轉移、預后差的特點。盡管我國黑色素瘤的發病率較歐美國家低[2]，但近年來呈現快速增長的趨勢，加之我國人口基數大，因此我國黑色素瘤患者的數量龐大[3-4]。近年來，新的有效系統診治方案的發展[5]，尤其是通過改善自身免疫系統自然防御機制的免疫治療的發展使患者的存活率大幅提高，抗腫瘤免疫治療日益受到人們的重視[6-8]。促吞噬肽(Tuftsin)是源于脾的活性四肽[9]，是一種生物反應調節劑。Tuftsin可以激活粒細胞、單核細胞和巨噬細胞，通過提高它們的趨化性、吞噬作用以及增強細胞毒性T淋巴細胞的細胞殺傷作用[10-12]，從而增強淋巴系統的細胞免疫活性，并表現出抗腫瘤作用[9,13-14]。但它在體內易被酶解，半衰期短，僅16 min，限制了其成藥性[15]。為了增加促吞噬肽的穩定性并延長其在體內的生物活性時間，人們開發了各種衍生物[15-17]。T肽是以Tuftsin為母體進行改造所得到的一種新型衍生物[18]，其由4個Tufsin經賴氨酸連接而成，分子量在2 000以上。這種連接結構使T肽在體內更穩定，半衰期延長為2～4 h[18-19]。初步研究表明，T肽在一定條件下表現出可靠且顯著的腫瘤抑制作用。在裸鼠移植瘤模型中，T肽能夠顯著抑制HepG2人肝癌、HT29人結腸癌和BGC-823人胃腺癌術后腫瘤生長，發揮抗腫瘤作用，抑制率可達60%以上[20]；在非免疫缺陷小鼠移植瘤模型中，T肽對術后腫瘤的生長抑制率高達70%以上。同時，在抗腫瘤研究中，T肽表現出良好的安全性，對小鼠體質量沒有明顯影響[21]。此外，An等[20]發現T肽可以與巨噬細胞中表達的特異性表面抗體結合，增強巨噬細胞的吞噬和細胞毒功能。根據這些結果，我們推測T肽對腫瘤的治療作用主要源于免疫系統的激活，但具體有哪些免疫細胞和免疫因子被激活尚不完全清楚。在本研究中，我們嘗試通過對T肽的體內外抗腫瘤活性研究和對免疫系統的激活作用研究，進一步探討T肽的抗腫瘤作用機制。

材料與方法

1 儀器和試劑 流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司，型號CytoFLEX)；細胞計數儀(美國Millipore公司，型號Scepter2.0)；移液器(德國Eppendorf公司)；酶標儀(Thermo Scientific Varioskan LUX多功能微孔板讀數儀)；二氧化碳培養箱(Thermo型號HERAcell240i)；培養瓶(美國Corning公司)；T肽為白色凍干粉末，純度大于98%，由解放軍總醫院藥學基礎研究室提供，批號：120903；APC/Cyanine7 anti-mouse CD3流式檢測抗體、FITC anti-mouse CD4流式檢測抗體、Per-CP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a流 式 檢 測 抗 體、PE/Cy7 anti-mouse/human CD44流式檢測抗體、APC anti-mouse NK-1.1流式檢測抗體、PE antimouse CD86流式檢測抗體、Brilliant Violet 421TManti-mouse CD206 (MMR)流式檢測抗體、Brilliant Violet 650TManti-mouse F4/80流式檢測抗體、Brilliant Violet 605TManti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)流式檢測抗體、Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (10X破膜液)、PE/DazzleTM594 antimouse/human CD11b流式檢測抗體(美國Biolegend公司)；IL-2 Elisa試劑盒、IL-4 Elisa試劑盒、IL-10 Elisa試劑盒、IL-12 Elisa試劑盒、TNF-α Elisa試劑盒、IFN-γ Elisa試劑盒、TGF-β Elisa試劑盒(美國Biolegend公司)；RPMI 1640細胞培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)。

2 細胞和實驗動物 B16-F10小鼠黑色素瘤細胞由軍事醫學科學院實驗室保存提供。C57BL/6小鼠12只，鼠齡6周左右，體質量(16.58±0.58) g，健康雌性，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司并飼養于解放軍總醫院實驗動物中心。試驗經解放軍總醫院動物實驗福利倫理委員會批準，授權編號為2019-X15-90。

3 B16-F10細胞移植性腫瘤模型的建立和分組處理 12只小鼠隨機分為兩組，即T肽組和對照組，每組6只。兩組小鼠右側前肢腋下接種黑色素瘤細胞懸液0.1 mL，含B16-F10細胞5×105個。腫瘤細胞接種后當天(第0天)T肽組小鼠皮下注射T肽(藥物劑量8 mg/kg)，實驗期間隔日給藥，共計給藥9次；對照組小鼠注射相同體積的0.9%氯化鈉注射液。待腫瘤生長至可見突起后隔日測量腫瘤的長短徑。

腫瘤體積按公式計算：V=L×W2/2(V=腫瘤體積，L=長徑，W=短徑)。

腫瘤生長抑制率(瘤重)=(空白對照組瘤重-給藥組瘤重)/空白對照組瘤重×100%。

4 流式細胞術檢測小鼠脾組織免疫細胞表達 在第17天處死小鼠，每組隨機取5只小鼠，無菌操作取小鼠脾，用眼科剪將脾剪碎成小塊，把脾放在網上，以5 mL注射器內芯輕輕搓組織塊，邊搓邊加0.9%氯化鈉注射液沖洗，直至完成，離心去上清；加入紅細胞裂解液3 mL，室溫放置5 min，離心去上清；用2 mL含10%胎牛血清RPMI 1640培養液重懸細胞，計數。取5×106個細胞置于24孔板內，并加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液至2 mL，培養72 h。收集細胞懸液于離心管內，離心后收集上清液，用于檢測細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β、IFN-γ的分泌量；另取含5×106個細胞的懸液置于流式檢測管，每管加入適量(200 μL)的預稀釋好的CD3、CD4、CD8、CD44、NK1.1、F4/80、CD86、CD11b、Gr-1流式檢測抗體；在空白管或同型對照管中加入與實驗組相同量的抗體對照試劑；各管避光在4℃冰箱中孵育30 min；加入1 mL細胞染色緩沖液，然后350 g離心5 min后棄上清液；每管內加入0.5 mL固定液，室溫、避光孵育20 min；離心棄去上清液；加入配制好的破膜液，離心后棄去上清液，重復1次。在每個流式檢測管中加入適量(200 μL)的預稀釋的CD206流式檢測抗體，室溫、避光孵育20 min；加入1 mL破膜液，350 g離心5 min后棄上清。用500 μL細胞染色緩沖液重懸細胞，過200目細胞篩，上機檢測免疫細胞的數量。

5 流式細胞術檢測小鼠移植瘤免疫細胞表達 在第17天處死小鼠，每組隨機取5只小鼠，用眼科剪取小鼠移植瘤，并將腫瘤組織剪碎成小塊，小心研磨，用200目篩網濾取細胞懸液于離心管內，離心去上清；加入紅細胞裂解液3 mL，室溫放置5 min，離心去上清；用2 mL RPMI 1640培養液重懸細胞，計數。取含5×106個細胞的懸液置于流式檢測管，每管加入適量(200 μL)的預稀釋好的CD3、CD4、CD8、CD44、NK1.1、F4/80、CD86、CD11b、Gr-1流式檢測抗體；在空白管或同型對照管中加入與實驗組相同量的抗體對照試劑；各管避光在4℃冰箱中孵育30 min；加入1 mL細胞染色緩沖液，然后350 g離心5 min后棄上清液；每管內加入0.5 mL固定液，室溫、避光孵育20 min；離心棄去上清液；加入配制好的破膜液，離心后棄去上清液，重復1次。在每個流式檢測管中加入適量(200 μL)的預稀釋的CD206流式檢測抗體，室溫、避光孵育20 min；加入1 mL破膜液，350 g離心5 min后棄上清。用500 μL細胞染色緩沖液重懸細胞，過200目細胞篩，上機檢測免疫細胞的數量。

6 小鼠血清和脾細胞培養上清液中免疫因子表達量測定 摘取小鼠眼球取血，收集血液于離心管內，在冰塊上靜置2 h，2 000 r/min離心10 min，收集上層血清,采用ELISA法測定血清和脾細胞培養上清液中免疫因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β、IFN-γ的表達量。

7 體外細胞毒性實驗 B16-F10小鼠黑色素瘤細胞培養基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，25 cm2培養瓶，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，隔日更換1次培養液，待細胞長滿培養瓶，收集細胞并用細胞計數儀計數，備用。將B16-F10小鼠黑色素瘤細胞以10 000/孔的密度接種在96孔板中。培養24 h后，更換培養液，使細胞在T肽濃度為0.1、1、5、10 μmol/L的培養基以及PBS(對照組)中繼續培養72 h。按照說明書操作，使用CCK-8測定細胞活性，在450 nm測定吸光值A，使用公式計算存活百分比：

8 統計學方法 采用GraphPad Prism 7統計分析軟件和SPSS23.0軟件進行統計學分析，實驗數據計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 T肽對移植腫瘤生長的抑制作用 兩組小鼠在接種腫瘤細胞前體質量無明顯差異；在實驗期間，兩組小鼠在相同的時間點體質量無明顯差異(圖1A)，T肽組小鼠移植瘤腫瘤體積和重量明顯低于對照組，移植腫瘤抑制率約為56.45%(圖1D)。

圖1 T肽抑制體內B16-F10腫瘤生長作用Fig.1 T peptide inhibits B16-F10 tumor growth in vivo

2 T肽對小鼠脾組織免疫細胞表達量的影響 流式細胞術檢測小鼠脾組織免疫細胞表達量，發現T肽可顯著升高荷黑色素瘤小鼠脾組織中CD8+T淋巴細胞(圖2A)、記憶性T細胞(CD3+CD44+)(圖2B)、髓系來源抑制細胞(CD11b+Gr-1+)(圖2D)和M1巨噬細胞(F4/80+CD86+)(圖2E)表達率，而對CD4+T淋巴細胞(圖2A)、自然殺傷細胞(NK1.1+)(圖2C)、M2巨噬細胞(F4/80+CD206+)(圖2F)表達率無明顯影響。

圖2 小鼠脾中各免疫細胞(流式代表圖和統計結果)Fig.2 FCM assay of splenocytes from tumor-bearing mice

3 T肽對移植瘤免疫細胞表達量的影響 流式細胞術檢測發現，皮下隔日注射T肽可顯著升高黑色素瘤小鼠腫瘤組織中記憶性T細胞(CD3+CD44+)(圖3A)表達率，而對CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞(圖3B)、自然殺傷細胞(NK1.1+)(圖3C)、髓系抑制細胞(CD11b+Gr-1+)(圖3D)、M1巨噬細胞(F4/80+CD86+)(圖3E)、M2巨噬細胞(F4/80+CD206+)(圖3F)表達率無明顯影響。

圖3 小鼠腫瘤組織各免疫細胞(流式代表圖和統計結果)Fig.3 FCM assay of immune cells infiltrating into tumors

4 T肽對小鼠血清和脾細胞培養上清液中免疫因子表達的影響 ELISA法檢測發現，T肽組脾細胞培養上清液和血清中IFN-γ(圖4G)分泌量顯著高于對照組，而IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、TNF-α、TGF-β分泌量與對照組相比無統計學差異(圖4A～圖4F)，提示T肽能提高細胞因子IFN-γ表達量。

圖4 T肽對脾細胞培養上清液和血清中細胞因子的影響(aP＜0.05；bP＜0.01)Fig.4 Effect of T Peptide on cytokines produced in the cultured supernatant of splenocytes and in serum (aP＜0.05；bP＜0.01)

5 T肽對細胞增殖的影響 采用CCK-8法測定B16-F10黑色素瘤細胞與不同濃度的T肽孵育72 h后的細胞活力。結果表明，T肽在0.1～10 μmol/L范圍內均不影響B16-F10細胞的增殖，亦未顯示對腫瘤細胞的濃度依賴性作用。見圖5。

圖5 不同濃度T肽對體外腫瘤細胞增殖的影響Fig.5 Effect of T peptides at different concerntrations on melanoma cells in vitro

討 論

本研究表明，T肽在體外對腫瘤細胞沒有細胞毒性，其體內抗腫瘤作用主要是由于免疫系統激活。荷瘤小鼠給予T肽后，CD8+T細胞、CD3+CD44+T細胞、MDSCs和M1巨噬細胞在脾中聚集的比例增加，IFN-γ表達增加。巨噬細胞在抗腫瘤免疫調節過程中發揮著重要作用，腫瘤基質中的腫瘤相關巨噬細胞可以在腫瘤微環境的調控下改變其表型，進化為抑制腫瘤生長的M1型或促進腫瘤進展的M2型。本研究發現T肽組小鼠脾中M1型巨噬細胞(F4/80+CD86+)的表達率升高，而M2型巨噬細胞(F4/80+CD206+)的表達率無明顯變化，說明T肽有利于腫瘤抑制性巨噬細胞(M1)的產生，該結果與文獻報道類似[20]。這些發現部分解釋了T肽對皮下移植瘤的抑制作用。

An等[20]報道T肽在鼠源性肉瘤細胞S180和肝癌細胞H22小鼠移植瘤模型中未顯著抑制腫瘤生長，認為T肽不會抑制體內腫瘤生長，本研究中T肽對B16-F10黑色素移植瘤的抗腫瘤作用顯著，導致不同結果的原因可能是T肽給藥時間不同。An等[20]的研究中，當腫瘤平均體積達到80 ～100 mm3時小鼠皮下注射T肽，本研究中自小鼠皮下接種細胞懸液當日即開始給予T肽，這進一步說明T肽是通過調動機體免疫力發揮抗腫瘤作用的，當外來腫瘤細胞在體內定植并形成瘤體后，機體免疫系統已受到影響，導致T肽的作用下降，不能表現出抑制腫瘤生長的作用。

髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)被認為是免疫抑制網絡的主要組成部分，在諸多病理條件下干擾T細胞功能，這些細胞可以抑制T細胞的增殖和B細胞的功能。本研究發現，T肽治療組脾組織細胞中CD11b+Gr-1+的表達率升高，提示T肽對MDSCs的表達和分布也有調節作用，相關機制值得進一步研究。

綜上，T肽可通過增加小鼠脾中CD8+T細胞和M1型巨噬細胞的水平，并增加免疫因子IFN-γ的表達來抑制小鼠黑色素瘤B16-F10細胞移植性腫瘤的生長，全面理解其腫瘤抑制作用機制還有待于更加全面系統的研究。