異氟烷在術后疲勞綜合征模型建立中的應用以及模型評價

賀子樂，薛 瑞，繳優優，張雯雯，魏棟棟，張有志，曹江北

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第一醫學中心 麻醉科 ，北京 100853；3 軍事科學院軍事醫學研究院 毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850

術后疲勞綜合征(postoperative fatigue syndrome，POFS)是指手術患者在術后出現疲勞、失眠、注意力不集中、抑郁、應激、焦慮等一系列癥狀的臨床綜合征[1-2]。POFS的成因包括生理和心理因素，機體受到手術創傷后產生免疫系統紊亂、神經-內分泌失調以及代謝狀況下降，從而引發POFS。其不僅是外科手術后的一種常見且重要的并發癥，也是導致術后其他器官系統并發癥的重要原因之一，嚴重影響患者術后康復[3-5]。POFS越來越受到臨床醫生的關注，而建立穩定有效的POFS模型對于研究POFS的發病機制和治療藥物具有重要意義。現有研究關于POFS模型建立的方法不一致，模型建立質量也參差不齊[6-7]。70%肝切除術是為模擬體內肝再生和細胞周期動力學而建立，研究發現進行70%肝切除后的大鼠出現自發活動減少、運動能力下降、記憶減退、毛發自潔能力下降等術后疲勞征象，是目前作為POFS研究的主要動物模型之一[7]。戊巴比妥鈉是目前動物實驗中的常用麻醉劑，具有安全范圍相對較大、麻醉維持時間長等特點[7-8]。但戊巴比妥鈉單一麻醉鎮痛效果差，劑量大時會引起嚴重的循環及呼吸系統抑制，嚴重時甚至導致動物死亡[9]。本研究擬進一步改進實驗模型，選用觀測指標豐富的C57BL/6小鼠建模，通過改進麻醉藥物和麻醉方式提高動物存活率，進而提高實驗效率。異氟烷作為廣泛使用的吸入麻醉藥，不僅對呼吸循環影響較小，且吸入后80%以氣體形式排出，對肝腎功能影響也較小，目前被應用于多種動物模型的建立[10]。POFS發病與麻醉因素密切相關，該模型建立過程中麻醉藥物的選擇可直接影響到模型建立效果，目前無研究報道使用異氟烷麻醉能否成功建立符合臨床POFS病理生理特點的動物模型。因此，本研究擬使用異氟烷作為麻醉藥物，通過與傳統麻醉藥物戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉比較，評估其用于建立POFS模型的可行性，并為進一步POFS相關機制研究提供實驗基礎。

材料與方法

1 實驗動物及分組 1)實驗動物： 雄性C57BL/6小鼠32只，體質量22～24 g，8～10周齡[斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2019-0010]。飼養環境溫度21℃～24℃，濕度40%～70%，12 h晝夜明暗交替(8：00 ～20：00)，自由攝食飲水，實驗前所有動物在安靜條件下適應性飼養7 d，術前12 h禁食不禁水，術后自由攝食飲水。2)動物分組：根據曠場實驗基線測試結果和體質量均衡隨機分為正常對照組(Con)、異氟烷麻醉假手術組(ISO Sham)、異氟烷麻醉70%肝切除組(ISO PHx)、戊巴比妥鈉麻醉70%肝切除組(NEMB PHx)，每組8只小鼠。本實驗已通過解放軍總醫院實驗動物福利倫理審查(批準文號：2020-X16-119)。

2 主要試劑和儀器 1)主要試劑：戊巴比妥鈉(國藥化學試劑集團有限公司)；異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；2)主要儀器：小動物氣體麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；通用活動箱及行為學分析軟件(上海吉量軟件技術有限公司)；小動物跑步機(江蘇賽昂斯生物技術有限公司)。

3 模型制備 1)正常對照組：不做麻醉及手術處理。2)NEMB PHx組：使用2%戊巴比妥鈉溶液以0.1 mL/10 g腹腔注射給藥。3)ISO Sham組和ISO PHx組： 將小鼠置于麻醉誘導箱中，開啟氧氣，調節氣流量(0.25 MPa，1 L/min)，調節異氟烷濃度為3%，小鼠翻正反射消失后，從誘導箱中取出，連接麻醉面罩維持麻醉深度，同時調節異氟烷濃度為1.2%。4)70%肝切除術方法：小鼠70%肝切除術參照文獻[11]，具體如下：ISO PHx組、NEMB PHx組麻醉成功后背部固定，腹部備皮并消毒后，沿腹白線開腹，暴露肝，結扎肝中央小葉及肝左小葉并切除，徹底止血，常規腹腔滴入青霉素預防感染，縫合切口。待小鼠翻正反射恢復后單籠飼養，并恢復自由攝食飲水。術后連續3 d肌內注射青霉素(100 kU/d)。ISO Sham組小鼠開腹后僅牽拉肝，其余操作同手術組。術后小鼠出現體質量下降、毛發自潔能力下降、自發活動減少、運動能力減退即判定為造模成功。5)術前術后觀察指標： 戊巴比妥鈉及異氟烷給藥后單獨放置，記錄給藥時間(T0)，翻正反射消失時間(T1)。翻正反射消失后進行手術，術畢記錄時間(T2)，翻正反射恢復時間(T3)。T0 ～T1為麻醉誘導時間，T2～T3為麻醉恢復時間。

4 術后動物觀測試驗 1)一般狀態監測：術后第0～7天每日記錄小鼠的一般情況，包括體質量(記錄第0～4天，第5天跑臺測試后對體質量產生影響不予統計)、攝食量(每組取7 d平均值)、毛發評分及瞇眼評分。2)毛發評分方法：對身體5個不同部位的評估,背部、頭面部、頸部、尾巴、前爪和后爪(由于手術原因，腹部不包括在內)，每個部位毛發整潔得分為0，毛發不整潔得分為1(毛發臟、毛粗、油膩、蓬松或密度低)。將身體各部分的得分相加，再除以身體各部分的總數，得到最終得分。瞇眼評分方法：全睜為0分，睜3/4為1分，睜1/2為2分，睜1/4為3分，全閉為4分[12]。3)曠場實驗：術后第0、1、3、6天采用曠場實驗檢測小鼠活動性。將小鼠放入自發活動測試箱(25 cm × 25 cm × 25 cm)，適應5 min后，記錄10 min內的運動距離。活動性下降，總移動距離減少視為疲勞。4)跑臺測試實驗：術后第5天采用跑臺實驗檢測小鼠運動耐力(圖1)。實驗分為兩個階段：第一階段為適應訓練階段，共3次，每次訓練時長分別為10 min、13 min、20 min。將小鼠置于不同跑道上，適應摸索3 min后，按下開始按鈕及各跑道電流按鈕，各個跑道上的小鼠都處于運動中，若有小鼠未運動或朝反方向運動則進行工具干擾，跑臺停止運行后小鼠進行短暫探索后回籠；第二階段為測試階段，將小鼠置于不同跑道上，讓小鼠在未運行跑道上適應摸索3 min后按下開始按鈕及各跑道電流按鈕，觀察小鼠是否出現呼吸急促、伏地式位于跑道后1/3段等疲勞癥狀，輕觸尾巴仍不繼續向前運動5次視為達到疲勞標準，將達到疲勞標準的小鼠所在的跑道暫停，并記錄此跑道的運行距離及時間[13]。

圖1 動物跑臺Fig.1 The treadmill of laboratory animals

5 統計學方法 所有實驗數據和圖片繪制均采用Graphpad Prism 9.0軟件，統計分析均采用SPSS23.0。計量資料以±s表示。多組間比較使用單因素方差分析 + 兩兩LSD-t檢驗。重復觀測資料則使用重復測量的兩因素方差分析 + 兩兩組間LSD-t檢驗+兩兩時間差值t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 麻醉效果比較 所有小鼠均麻醉成功，正常對照組不做麻醉處理。與NEMB PHx組相比，ISO Sham組和ISO PHx組麻醉誘導時間縮短[T0 ～T1：(0.89±0.35) minvs(3.65±0.63) min，(0.95±0.27) minvs(3.65±0.63) min，P均＜0.001，圖2A]，與NEMB PHx組相比，ISO Sham組和ISO PHx組麻醉恢復時間縮短[T2～T3：(1.54±0.38) minvs(205.57±27.95) min，(1.85±0.94) minvs(205.57±27.95) min，P均＜0.001，圖2B]。

圖2 各組小鼠麻醉效果比較(aP ＜ 0.001, vs NEMB PHx)Fig.2 Comparison of anesthesia effect in each group (aP ＜ 0.001,vs NEMB PHx)

2 POFS模型一般狀態比較 與正常對照組相比，ISO PHx組和NEMB PHx組術后第1、2、3、4天出現體質量下降，NEMB PHx組術后體質量下降幅度大，差異有統計學意義(P＜0.05，圖3A)；ISO PHx組和NEMB PHx組術后7 d每日平均攝食量均減少(圖3B)；與NEMB PHx組相比，ISO PHx組術后第1、2天毛發評分較低(D1：0.03 ± 0.03vs0.25 ± 0.08，D2：0.03 ± 0.03vs0.22 ±0.05，P均＜0.05，圖3C)，術后第3～7天，各組小鼠自潔能力恢復，毛發評分均為0分；術后當天，ISO PHx組小鼠瞇眼評分顯著低于NEMB PHx組，差異有統計學意義(0vs1.22 ± 0.36，P＜0.01，圖3D)，術后2～7天，各組小鼠瞇眼評分均為0分。

圖3 各組術后一般狀態比較(aP ＜ 0.05, bP＜0.01)Fig.3 Comparison of general state of postoperative patients in each group (aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01)

3 曠場實驗檢測小鼠自發活動性 與正常對照組相比，ISO PHx組術后第0、1、3天曠場自發活動運動距離顯著下降(第0、3天P＜0.001，第1天P＜0.01，圖4A)，NEMB PHx組術后第0、1、3天曠場自發活動運動距離顯著下降(P均＜0.001，圖4A)。與NEMB PHx組相比，ISO PHx組術后第1天曠場自發活動運動距離增加(P＜0.05)，第0、3、6天兩組小鼠曠場自發活動運動距離無統計學差異(圖4A)。術后第5天小鼠跑臺測試后進行曠場實驗檢測自發活動性觀察小鼠運動后恢復能力，與正常對照組相比，ISO PHx組和NEMB PHx組曠場自發活動運動距離均顯著下降(P均＜0.01)；NEMB PHx組與ISO PHx組曠場自發活動運動距離無統計學差異(圖4B)。

圖4 曠場實驗各組小鼠自發活動運動距離(aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01,cP ＜ 0.001, vs Con;aP ＜ 0.05, vs NEMB PHx)Fig.4 Open-field spontaneous activity distance of each group (aP ＜0.05, bP ＜ 0.01, cP ＜ 0.001, vs Con;aP ＜ 0.05, vs NEMB PHx)

4 跑臺實驗檢測運動耐力 與正常對照組相比，術后第5天ISO PHx組(P＜0.05)和NEMB PHx組(P＜0.01)跑臺運動距離均顯著下降。NEMB PHx組與ISO PHx組術后第5天跑臺運動距離無統計學差異(圖5)。

圖5 術后第5天各組小鼠跑臺運動距離(aP＜0.05, bP＜0.01, vs Con)Fig.5 Distance of treadmill on day 5 after operation (aP＜0.05,bP＜0.01, vs Con)

討 論

POFS是外科手術后一種常見且重要的并發癥，其患病率為50%～90%[11]。導致POFS的原因很多，有文獻報道腹部大手術是導致POFS的主要手術類型之一[14-15]。POFS可分為外周型和中樞型，前者主要表現為骨骼肌功能下降，后者表現為認知功能障礙、大腦功能受損。POFS可延長患者術后康復進程，給患者預后和生活質量帶來負面影響，增加社會衛生服務成本[11]。

動物模型作為疾病研究的重要載體，在多種疾病的機制研究中起著非常重要的作用。穩定、標準的POFS模型以及可靠的評價體系對POFS病因和防治領域的研究具有重要意義，有助于POFS病因學研究、治療策略改進及藥物療效評估。目前，POFS模型建立方法主要有70%腸切除吻合術[16-19]和70%肝切除術[7,20]。相對于70%腸切除吻合術，70%肝切除術具有手術簡單易于掌握、操作時間短、動物成活率高等優點。研究發現，70%肝切除相較于50%和30%肝切除能更好地模擬臨床發生術后疲勞患者的生理改變。本研究組前期研究發現選用SD大鼠進行造模術后恢復速度快、行為學觀測窗口期較窄且觀測指標單一，所以嘗試使用C57BL/6小鼠進行70%肝切除術建立POFS模型。但肝是藥物代謝的重要場所，肝大部分切除后可導致靜脈或腹腔注射麻醉藥物的代謝異常，嚴重時可導致麻醉動物意外死亡。因此能否選擇一種新的麻醉藥物和麻醉方式是POFS模型建立過程中需重點關注的問題。

吸入性麻醉藥異氟烷已成功應用于多種動物模型的建立[21-22]。它具有對小鼠的生命體征影響較小、能夠維持良好的組織供氧、麻醉深度容易調節且可控性良好等優點。同時研究還提示異氟烷對肝和大腦的缺血再灌注損傷有一定的保護作用[23-25]。本研究結果顯示，在小鼠POFS模型建立過程中選用異氟烷麻醉，相較于傳統戊巴比妥鈉麻醉，具有誘導時間短、術后蘇醒迅速、麻醉維持時間相對可控等優點。在成功建立POFS模型的基礎上，異氟烷麻醉小鼠術后一般狀態要優于戊巴比妥鈉麻醉小鼠。

術后活動水平降低和運動耐力下降是POFS模型成功建立的行為學證據[6,26]。我們的研究結果顯示，采用異氟烷吸入麻醉與傳統的戊巴比妥鈉麻醉均出現了POFS模型小鼠典型疲勞現象，即兩組小鼠均出現自發活動移動距離和跑臺運動距離顯著下降；同時兩組小鼠均出現了類似的瞇眼、體質量下降、攝食量減少、毛發自潔能力下降等表現，呈現出明顯的疲勞狀態。兩組小鼠均可以較好地模擬臨床術后疲勞患者四肢倦怠、體力不支、食欲缺乏癥狀，符合臨床疾病研究模型表觀有效性的建立要求。本研究發現，術后第5天POFS模型仍表現為運動耐力下降和活動性下降，表明70%肝切除后小鼠的術后疲勞表型維持時間至少為5 d。

綜上所述，本研究采用不同的麻醉方法均成功建立了POFS模型，與臨床POFS患者的表現特點相符，在模型建立過程中，相對于戊巴比妥鈉麻醉，使用異氟烷吸入麻醉建立POFS動物模型時麻醉誘導時間和恢復時間均縮短，可控性好，效果更優，有利于后續藥物評價和病理生理機制研究，可以作為POFS模型建立的較優麻醉劑。