菟絲子總黃酮對小鼠睪丸間質細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的影響

李利娟，劉文濤，羅歡歡，孟曉彤，柴冰茹，谷 雨，廖禮彬，白生賓

1 新疆醫科大學 基礎醫學院，新疆烏魯木齊 830011；2 解放軍總醫院醫學創新研究部 學報編輯部，北京 100853

睪丸間質細胞是睪丸組織中合成并分泌雄性激素的主要細胞，在精子發生和成熟過程中發揮至關重要的作用[1]。研究表明，睪丸間質細胞凋亡可引起睪丸損傷，從而引發生精功能障礙，導致男性不育[1-2]。因此，維持間質細胞正常功能對保護男性生殖健康有重要意義。菟絲子總黃酮(total flavonoids from semen cuscutae，TFSC)作為菟絲子的主要活性成分之一，具有抗炎、抗凋亡等作用，同時對精子的活率和細胞的活力具有明顯的保護作用[3-5]。研究表明，TFSC可通過MAPK信號通路緩解雙酚A誘導的小鼠睪丸間質細胞凋亡，提高睪丸間質細胞分泌的睪酮含量，維持睪丸的正常功能[6]。為進一步探究TFSC緩解睪丸間質細胞凋亡作用與Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡關鍵蛋白的關系，本實驗以小鼠睪丸間質細胞系TM3細胞作為研究對象，探討TFSC抑制TM3細胞凋亡的可能作用機制，為其治療男性不育提供實驗數據。

材料與方法

1 實驗材料和試劑 TM3細胞、TM3細胞專用培養基(武漢普諾賽生命科技有限公司)；胎牛血清(BI)；CCK-8試劑盒(Biosharp)；抗Bax抗體、Caspase-3抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；抗Bcl-2抗體、抗GAPDH抗體(英國Abcam公司)；山羊抗兔IgG-HRP(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白酶抑制劑、高效RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(美國BD Pharmingen公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；Acrolein(國藥集團)；菟絲子總黃酮(南京澤朗生物技術有限公司)。Herocell 180型CO2恒溫培養箱(上海潤度生物科技有限公司)；CytoFLEX型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；全波長酶標儀、Western blot垂直電泳槽、轉印槽、成像分析儀(美國Bio Rad公司)。

2 細胞培養 用TM3細胞專用培養基(含5%HS+2.5% FBS+1%雙抗的DMEM/F12基礎培養基)于37℃、5% CO2培養箱中進行TM3細胞的常規培養，待細胞密度生長至80%左右時，用0.25%的胰酶消化細胞，進行傳代處理。本實驗選用3～5代細胞。

3 CCK-8檢測細胞增殖活性 為篩選TFSC和丙烯醛(acrolein，ACR)的最佳處理濃度，選用對數生長期的TM3細胞，調整細胞密度為5×104/mL，每孔加入100 μL細胞懸液在96孔板中，置于37℃、5% CO2培養箱內培養過夜。待TM3細胞貼壁且生長穩定后，按照TFSC(0、25、50、100、200、400、600 μg/mL，作用24 h)和ACR(0、10、50、100、200、400 μmol/L，分別作用4、12、24 h)濃度梯度進行藥物干預。于每孔中加入10 μL CCK-8試劑，輕輕混勻，37℃孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm波長處各孔細胞的光密度(optical density，OD)值。篩選細胞存活率為50%時的ACR(即IC50)濃度和對TM3細胞增殖作用最明顯的TFSC濃度為后續實驗濃度。

4 實驗分組及細胞損傷模型的建立 將TM3細胞接種在6孔板中，在37℃、5% CO2的條件下培養過夜。待細胞貼壁且生長狀態良好時，分別設置對照組(加入等量培養液培養24 h)、模型組(加 入 含35 μmol/L ACR的 培 養 液 培 養24 h)、TFSC低、中、高劑量組(先用35 μmol/L ACR培養24 h后，分別加入含100、200、400 μg/mL TFSC的完全培養基干預24 h)。

5 Annexin V/PI檢測細胞凋亡 根據細胞凋亡試劑盒說明書操作。將對數生長期的TM3細胞以1×105/孔接種于6孔板，培養12 h后，棄去培養液。按照實驗分組對細胞進行相應處理后，用無EDTA胰酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞，棄上清。用預冷PBS將細胞洗兩遍，加100 μL 1 × Binding Buffer使細胞重懸，轉移至1.5 mL EP管，分 別 加5 μL Annxeni V-FITC和5 μL PI染液，混勻后室溫避光孵育15 min。最后加入400 μL 1 × Binding Buffer，輕輕混勻，過篩至流式管，流式細胞儀上機檢測，1 h內檢測完畢。

6 Western blotting檢測小鼠睪丸間質細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達 提取TM3細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度的測定。按1∶5的比例加5 × SDS上樣緩沖液，100℃水 浴10 min。10% SDS-PAGE凝 膠 上 樣15 μg，電泳結束后將蛋白轉到PVDF膜上。用TBST配置的5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗3次，10 min/次。加兔抗鼠多克隆抗體(抗體稀釋比例：Bcl-2 1∶1 000；Bax 1∶1 000；GAPDH 1∶5 000)，4℃條件下孵育過夜。充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀釋比例1∶1 000)室溫孵育2 h。使用ECL增強化學發光顯影，凝膠圖像分析儀分析結果。

7 統計學分析 采用SPSS26.0軟件分析數據，實驗數據均以±s表示。多組之間數據分析采用One-way ANOVA單因素方差分析，采用Tukey檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TFSC和ACR對TM3細胞增殖活力的影響 CCK-8檢測結果顯示，TFSC在一定濃度范圍內可促進TM3細胞增殖，且濃度為100、200、400 μg/mL時，TM3細胞的增殖效果明顯(P＜ 0.05，圖1A)。不同濃度(0、10、50、100、200、400 μmol/L)的ACR在不同時間點對TM3細胞增殖具有一定抑制作用，且隨著ACR濃度的增高，細胞活性逐漸降低，除4 h和12 h 10 μmol/L ACR濃度組外，其余ACR各處理組的細胞活力均明顯降低(P＜0.05，圖1B)。說明ACR抑制睪丸間質細胞增殖，其抑制作用呈劑量依賴性。4 h、12 h、24 h這三個時間點ACR的IC50分別為112、73.16和33.97 μmol/L，最終選擇35 μmol/L ACR作用24 h進行后續實驗的研究。

圖1 TFSC(A)和ACR(B)對TM3細胞增殖活力的影響(aP ＜0.05, vs TFSC 0 μg/mL)Fig.1 Effects of TFSC (A) and ACR (B) on TM3 cell viability (aP ＜0.05, vs TFSC 0 μg/mL)

2 TFSC對ACR誘導的TM3細胞形態和增殖能力的影響 各組細胞形態倒置顯微鏡下觀察結果顯示(圖2A)，對照組細胞呈梭形或多邊形、上皮樣，排列緊密，界限清晰。與對照組比較，模型組細胞皺縮，甚至變圓脫落，細胞間隙增加，數量明顯減少，培養液中漂浮細胞及細胞碎片明顯增加。與模型組比較，TFSC低、中、高劑量作用一段時間后，可在一定程度上恢復細胞生長狀態，明顯增加細胞數量，減少漂浮細胞，增強細胞活力，中、高劑量組效果顯著(P＜ 0.05)，但未恢復到正常水平(圖2B)。

圖2 TFSC對ACR誘導的TM3細胞生長狀態和細胞活性的影響Fig.2 Effect of TFSC on the growth status and cell viability of ACR-induced TM3 cell

3 菟絲子總黃酮對抑制TM3細胞凋亡的影響 與對照組(細胞凋亡率11.68% ± 1.84%)比較，模型組細胞凋亡率(20.02% ± 0.41%)明顯增加(P＜0.05)，用TFSC低、中、高劑量作用一段時間后，細胞凋亡率分別為18.62% ± 0.73%、16.47% ±1.53%、15.5% ± 0.91%，相較于模型組，TFSC中、高劑量組細胞的凋亡率顯著降低(P＜ 0.05，圖3)。

圖3 流式細胞儀測不同濃度TFSC對ACR誘導TM3細胞凋亡的影響Fig.3 Influence of TFSC with different concentrations on the apoptosis of TM3 cell induced by ACR (Flow cytometer )

4 菟絲子黃酮對TM3細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組 Bax 、Caspase-3蛋白表達明顯升高(P＜ 0.05)，Bcl-2蛋白的表達明顯下降(P＜ 0.05)。與模型組比較，TFSC中、高劑量組Bax、Caspase-3蛋白的表達明顯下降(P＜ 0.05)，TFSC低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達明顯升高(P＜ 0.05，圖4A～圖4D)。

圖4 TFSC對ACR誘導的TM3細胞Bcl-2、Caspase-3、Bax蛋白表達的影響Fig.4 Effects of TFSC on the protein expression levels of Bcl-2, Caspase-3 and Bcl-2 of ACR-induced TM3 cells

討 論

男性不育是人類生殖健康的一個重大問題，引起男性不育的因素很多，且機制復雜，其中睪丸間質細胞凋亡是導致生殖功能降低的一個重要方面。睪丸間質細胞的主要功能是參與睪酮的合成與分泌，機體內約90%的睪酮是睪丸間質細胞產生，在維持生精功能中發揮重要作用[7-9]。因此，睪丸間質細胞的數量和功能正常在生精過程中是十分重要的。ACR是臨床上常用的抗腫瘤藥物環磷酰胺的主要毒性代謝產物，除此之外，還來源于汽車尾氣、煙霧、過熱的食用油等[10]。研究發現，ACR可破壞細胞中的蛋白質，引起DNA損傷和脂質過氧化反應，從而使細胞發生凋亡[11-13]。本實驗以不同濃度ACR處理TM3細胞，結果顯示隨著ACR濃度的升高，TM3細胞存活率逐漸降低，且具有一定的劑量依賴效應。菟絲子是臨床上常用的一味補腎中草藥，菟絲子黃酮是其主要成分，在治療男性不育方面有一定的成效。研究表明菟絲子黃酮可改善睪丸的生精功能，促進睪丸生殖細胞增殖，促進睪酮分泌[14-15]。本實驗結果顯示TFSC在100、200、400、600 μg/mL濃度時可以促進TM3細胞增殖。此外，TFSC能夠緩解ACR誘導TM3細胞損傷，中、高劑量組作用明顯(P＜0.05)。流式結果顯示，與對照組相比，ACR模型組TM3細胞的凋亡率明顯增加(P＜0.05)，TFSC中、高劑量組明顯降低TM3細胞的凋亡率(P＜0.05)，這進一步提示菟絲子黃酮能夠抑制ACR誘導的TM3細胞凋亡。

細胞凋亡是機體內細胞的程序性死亡，在機體內環境的維持和多個系統的發育中發揮重要作用，細胞凋亡受Bcl-2家族、Caspase家族等多個基因的嚴格調控。近年來研究表明睪丸間質細胞的凋亡受多個因素和基因的調控，主要有Bcl-2、Caspase-3等[16-19]。Bcl-2家族蛋白是通過調節促凋亡與抗凋亡之間的平衡來維持線粒體的完整性的一類關鍵蛋白[20]。Bax可通過增強線粒體膜通透性，改變跨膜電位，從而促使線粒體內細胞色素C釋放到細胞質中，引起半胱氨酸天冬氨酸酶的級聯反應，最終導致Caspase-3被激活，引發細胞的凋亡[21-24]。Bcl-2蛋白可以通過抑制凋亡蛋白引發的一系列信號激活發揮抗凋亡作用[23-24]。為探究菟絲子總黃酮抑制TM3細胞凋亡的可能分子作用機制，我們進一步對凋亡相關蛋白的表達進行了相應的檢測。本實驗結果表明，在TM3細胞中，ACR通過降低抗凋亡的Bcl-2蛋白表達，增加促凋亡的Bax和Caspase-3蛋白表達，導致細胞發生凋亡，而在不同濃度TFSC干預后，與 ACR模型組相比，Bax和Caspase-3蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高。提示TFSC可通過改善抗凋亡與促凋亡蛋白的失衡以緩解間質細胞凋亡。

綜上所述，菟絲子總黃酮能夠促進睪丸間質細胞的增殖，降低丙烯醛誘導的小鼠睪丸間質細胞損傷，減少小鼠睪丸間質細胞的凋亡，其抗凋亡作用可能與Bcl-2蛋白表達上調和Bax、Caspase-3蛋白表達下調有關。本實驗僅對TFSC抑制TM3細胞凋亡的分子作用機制做了初步探討，對其具體的信號分子通路的作用仍待更深入的研究。