前房注射角膜內皮細胞治療兔大泡性角膜病變的實驗研究

方逸凡，楊昆昆，李 釗，張世鋒，侯月陽，吳 畏，王麗強，黃一飛

解放軍總醫院第一醫學中心 眼科，北京 100853

角膜內皮細胞是位于角膜后彈力層的六邊形單層細胞，通過泵和屏障功能維持角膜正常的水合作用，是維持角膜透明度和發揮視覺功能必不可少的組織結構[1]。人角膜內皮細胞不可再生，且會隨著年齡增長或各種疾病的發生而丟失，當失去代償能力不能維持基質水合作用時，會導致角膜水腫甚至視力下降，臨床上稱為大泡性角膜病變[2]。角膜移植是治療大泡性角膜病變的唯一方式，但移植手術對技術要求較高，加之供體來源有限，導致其難以大量開展[3-4]。近年有研究采用前房注射培養原代角膜內皮細胞(corneal endothelial cell，CEC)治療大泡性角膜病變，在5 年的隨訪中(10例/11例)取得良好臨床效果，簡化手術步驟同時充分利用供體角膜，為治療此疾病提供了里程碑式的技術手段[5-8]。以往機械刮除法將角膜內皮和后彈力層一起去除，造成角膜內皮細胞前房注射治療效果差異大，難以評價種子細胞的療效[9]。本研究改良動物模型的制備方法，僅去除內皮組織而不損傷后彈力層，并通過前房注射細胞的方式進行治療，以期為前房注射療法的臨床轉化提供臨床前研究數據和均一穩定的動物模型。

材料與方法

1 實驗動物 選用雄性新西蘭白兔21只，體質量2.5～3.0 kg，由解放軍總醫院實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(京)2020-0002]，飼養于溫度23℃，濕度40%，12 h光照/黑暗交替環境中，活體動物的實驗操作均在8：00 - 17：00進行。實驗過程符合美國視覺與眼科學研究協會(ARVO)制定的規范，實驗方案經解放軍總醫院動物實驗倫理委員會審查批準(2021-X17-27)。

2 主要試劑和儀器 淚道引流管(山東福瑞達醫療器械有限公司)；1 mL和20 mL注射器(山東威高)；鹽酸賽拉嗪注射液(吉林省華牧動物保健品有限公司)；鹽酸咪達唑侖注射液(恩華)；醫用透明質酸鈉凝膠(博士倫 愛維)；肝素鈉注射液(山東省惠諾藥業有限公司)；胎牛血清(Gibco)；高糖DMEM培養基(Corning)；青鏈霉素(Gibco)；膠原酶Ⅰ(Sigma)；ZO-1抗體(invitrogen#33-9100)；硫酸慶大霉素注射液(辰欣藥業有限公司)；鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天藥業)；妥布霉素地塞米松滴眼液(NOVARTIS)；0.4%錐蟲藍染液(Gibco)；茜素紅(sigma)；15°角膜穿刺刀(TRIMMER)；手術顯微鏡(Leica)；前節OCT(Carl Zeiss Visante OCT,Germany)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS Ⅸ53)；光學顯微鏡(OLYMPUS BX53)。自行制備內皮刮除器械：在現有淚道沖洗器上基礎上，將淚道探針尾部硅膠管移動至頂端并超出2 mm作為內皮刮除的工作部；去除多余硅膠管，不銹鋼探針在距頂端2.5 cm處反折135°，尾部包繞在注射器針筒上，各連接部位依次固定(圖1)。

圖1 內皮刮除器械設計和制備 A：示意圖；B：術中操作圖Fig.1 Design and preparation of endothelial scraping equipment A: equipment design; B: operation in rabbits

3 兔原代角膜內皮細胞培養和鑒定 原代細胞培養按照“兩步法”[7,10]獲得單細胞：3只1 kg雄兔安樂死后取眼球，去除眼周結締組織，浸泡在1%青鏈霉素-PBS溶液中30 min，顯微剪剪下角膜鞏膜環，浸泡在無血清的高糖DMEM中，有齒鑷夾住鞏膜環，無齒鑷沿角膜緣撕除后彈力層。完整的后彈力層放在2 mg/mL膠原酶Ⅰ中，37℃、5%CO2培養箱消化1～2 h。觀察到角膜內皮細胞形成團簇后加入1 × TE酶消化3 min，進一步分離成更小的細胞，1 000 r/min離心5 min，10% FBS +高糖DMEM培養基重懸細胞沉淀，接種在6孔板中，此細胞為P0代，隔天換液，3 d傳代，P2代細胞用于移植及后期實驗。4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Triton-100破膜，山羊血清工作液封閉30 min，按說明書步驟1∶100稀釋ZO-1抗體，4℃過夜，1∶500稀釋綠色熒光二抗，DAPI染核，熒光顯微鏡拍照。

4 大泡性角膜病變模型制備 動物禁食8 h，賽拉嗪和咪達唑侖1∶1混合，按照0.35 mL/kg比例肌內注射全身麻醉，取左側臥位，術眼眼周碘伏消毒鋪單，鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉后，慶大霉素(400 U/mL)沖洗結膜囊。15°角膜穿刺刀在10點位做角鞏膜緣切口，肝素-BSS水(5 U/mL)沖洗前房，注入黏彈劑，自制硅膠針頭刮除全部角膜內皮，手動注吸黏彈劑，0.04%錐蟲藍染色2 min，證實內皮細胞刮除干凈后10-0縫線縫合角鞏膜穿刺口。

5 實驗分組和處理 按照隨機數表法將18只兔分為2組，每組9只。兩組均由同一術者建立大泡性角膜病變模型。操作時使用29G胰島素針頭從透明角膜斜行穿刺，實驗組(CEC組)注射100 μL細胞懸液(含106個細胞 + Y27632)，對照組(Con組)注射等體積無血清DMEM + Y27632，術后保持全麻狀態，術眼向下臥位3 h促進細胞黏附。術后術眼使用妥布霉素地塞米松滴眼液點眼，3次/d。注射時遵循盲法，即事先由另一人負責制備細胞懸液并進行實驗動物分組和標號，術者前房注射前不清楚注射液種類。

6 前節OCT測角膜厚度 分別在注射后1 d、4 d、7 d、14 d使用前節OCT高分辨率角膜四象限模式掃描角膜0°～180°、45°～225°、90°～270°和135° ～315°的截面，取中央角膜厚度的平均值用于統計學分析[11]。

7 前節照相評估角膜混濁程度 分別在注射后1 d、4 d 、7 d、14 d拍攝眼前節照片，使用0～4的等級對角膜透明度進行評分[12]：0分=完全透明；1分=輕微混濁，虹膜和瞳孔易見；2分=略微不透明，虹膜和瞳孔隱見；3分=不透明，瞳孔難見；4分=完全不透明，看不到瞳孔。評分由本專業非實驗人員獨立完成。

8 角膜組織學觀察 注射14 d后，過量戊巴比妥鈉靜脈注射處死動物，取角膜組織，撕除1/3后彈力層，內皮面向上用1%茜素紅染色3 min，PBS洗3次后鋪片顯微鏡下觀察[13]；剩余2/3角膜組織用4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋切片，厚度6 μm，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察角膜組織學變化。

9 統計學分析 使用Graphpad7.0進行統計學分析，兩組角膜厚度為計量資料，均以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 大泡性角膜病變模型評價 術中錐蟲藍染色顯示角膜內皮刮除范圍均勻完整(圖2A)，術后HE和茜素紅結果顯示后彈力層完整，未發生脫離且內皮細胞被成功刮除，說明模型制備成功(圖2B，圖2C)。

圖2 內皮刮除效果評估 A：刮除后0.04%臺階藍染色確定刮除范圍；B：刮除后立即取材進行HE染色，觀察后彈力層(箭頭所示)連續且完整；C：刮除后茜素紅染色未見內皮結構Fig.2 Evaluation of the effect of endothelial A: 0.04% Trypan blue staining after scraping to determine the scraping area;B: HE staining after scraping; Descemet's membrane was intact and continuous (arrow); C: no endothelia remained in alizarin red

2 原代角膜內皮細胞培養和鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察到角膜后彈力層在培養基中呈卷曲狀態，膠原酶消化能力較為溫和，長時間的消化破壞了細胞與后彈力層間的鈣黏蛋白并很好地保持了內皮細胞的活性，重懸貼壁后呈典型的“六邊形”形態(圖3B)。采用免疫熒光檢測細胞表面緊密連接蛋白ZO-1可以觀察到蛋白的表達(圖3C)，證實該消化方法對于角膜內皮的膜表面蛋白損傷較小且無其他細胞沾染。

圖3 兔原代角膜內皮體外培養及鑒定 A：內皮細胞貼壁后倒置相差顯微鏡圖(4×)；B：內皮細胞免疫熒光染色(10×)(藍色：DAPI；綠色：Z0-1)Fig.3 In vitro culture and identification of rabbit primary corneal endothelium A: image of endothelial cells in culture dish(4×); B: endothelial cell immunofluorescence staining (10×)(Blue: DAPI; Green: ZO-1)

3 角膜厚度透明度觀察 CEC組在細胞注射7 d時可達到臨床治愈(角膜厚度 ＜ 500 μm)，Con組角膜厚度大于CEC組，差異有統計學意義(P＜0.05)，14 d時兩組角膜厚度均大致恢復正常(圖4B)，其他時間點兩組角膜厚度差異無統計學意義(P＞ 0.05)。在上述時間點分別進行眼前節照相，進行混濁程度評分，結果與角膜厚度變化一致；7 d時CEC組基本恢復透明而對照組仍混濁，14 d后基本恢復透明狀態(圖5A，圖5B)。

圖4 兩組角膜厚度變化：與Con組相比，CEC組在細胞注射7 d后角膜厚度顯著降低（aP＜0.05）Fig.4 Corneal thickness changes: compared with the Con group, the corneal thickness in the CEC group decreased significantly at 7 days after the cell injection (aP＜0.05)

圖5 兩組角膜混濁程度分析 A：裂隙燈拍照，在第7天時CEC組大致恢復透明而Con組混濁；B：角膜混濁度評分隨時間變化折線圖(n=9)Fig.5 Analysis of corneal opacity in the two groups A: slit-lamp photograph: the CEC group was almost transparent on 7 d, but the Con group was still opaque; B: the corneal opacity score (n=9)

4 組織學觀察 14 d時HE染色見Con組角膜基質部分水腫，上皮下散在大泡形成，CEC組較Con組基質纖維排列更為致密有序(圖6A)；茜素紅染色見CEC組存在規則的“六邊形”內皮結構(圖6B)，Con組仍存在部分區域內皮缺失，且內皮形態呈現“多形性”(圖6C)。

圖6 兩組組織學觀察 A：HE染色；B：CEC組茜素紅染色；C：Con組茜素紅染色Fig.6 Histology observation A: HE staining; B: the Alizarin Red staining of the CEC group; C: the Alizarin Red staining of Con group

討 論

目前，角膜供體來源缺乏，細胞療法治療大泡性角膜病變被認為是一個再生醫學與組織工程結合的新興研究領域，在理論上提供了角膜內皮組織的無限來源，同時降低了免疫排斥反應[14-15]。Pan等[16]將小鼠成纖維細胞通過小分子化合物成功誘導為角膜內皮樣細胞，并采取前房注射的方式在兔大泡性角膜病變中取得成功，進一步擴大了種子細胞來源和譜系；Ali等[17]將多能干細胞誘導的內皮樣細胞前房注射到恒河猴大泡性角膜病變中取得一定療效，證明了前房注射移植細胞在高等動物中的應用價值。盡管兔角膜內皮細胞具有增殖能力，但損傷后14 d角膜內皮并不能完全自行愈合；而本實驗組注射細胞后7 d即可達到臨床愈合，愈合時間短于兔角膜內皮的自行愈合。由此說明前房注射功能性種子細胞替代病變或丟失的角膜內皮可以治療大泡性角膜病變，本研究結果與既往報道大致相同[18]，本實驗中使用的種子細胞來源于同種異體細胞的體外擴增，嚴格按照隨機、對照、盲法的操作，進一步證實前房注射細胞這一療法的有效性。

同時本實驗改良了現有手術器械，保留了兔角膜后彈力層。后彈力層是角膜內皮的基底膜，作為細胞黏附的支架位于內皮的基底側[19]。基底膜的成分與相應的整合素結合，通過招募細胞接頭蛋白、磷酸化結合蛋白和結合接頭蛋白至肌動蛋白細胞骨架來啟動從細胞外到細胞內的信號傳遞[20]。因此保留后彈力層對于注射細胞的黏附至關重要。既往構建大泡性角膜病變動物模型使用的20G硅膠針頭(Inami & Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)造價較為昂貴，手術時間長且不易通過角膜穿刺口[21]。本文自制了一種組裝簡單、經濟實用、操作簡便、損傷部位準確可控的手術器械，在動物模型的制備中取得與上述器械相似的手術效果[18,22-24]。為之后可能的小分子化合物篩選、藥物載體或支架構建，以及多種來源種子細胞的功能驗證提供了一種工具。2013年Koenig[25]發現Fuchs角膜內皮營養不良的患者病程早期去除病變的角膜內皮后角膜重新恢復透明，這一手術也保留了患者的后彈力層，進一步擴大了該類型手術器械的使用范圍，如DWEK(descemetorhexis without endothelial keratoplasty)臨床治療[26]。因此，該手術器械不僅可以用于動物模型構建，將來或許也可用于臨床治療。

小分子化合物Y27632是ROCK通路抑制劑，可以通過激活PI3K/Akt信號傳導，促進CEC黏附和增殖進而促進角膜損傷修復，與種子細胞共遞送可以增加其功能，已成為內皮細胞前房遞送和培養的常規添加物質[6,14]。其衍生物已作為臨床藥物在日本常規應用[27]。本實驗中兩組采用該小分子化合物是為了評價角膜內皮細胞的在體內是否有功能，不能排除該小分子化合物本身促進角膜內皮再生的作用。

前房注射是經透明角膜以簡單和微創的方式傳遞CEC。細胞注射后，必須保持2～3 h的俯臥位，與ROCK抑制劑Y-27632地共遞送，細胞更容易黏附[23]。本研究注射106個細胞是根據既往文獻報道確定[14]，對于細胞的濃度梯度未進行進一步探討，仍存在著自身細胞遷移和注射后種子細胞的混合作用干擾問題，對于前房注射細胞的最適宜數量和最終命運轉歸未進行深入研究。

總之，本研究通過細胞前房注射探究其對改良兔大泡性角膜病變動物模型的治療作用，證實了前房注射療法的有效性；改良式動物模型可作為未來種子細胞驗證、藥物和小分子化合物篩選的臨床前研究模型。