PP2A在中耳膽脂瘤中的表達及其與骨質破壞的相關性

趙 香 魏曉麗 李曉輝 佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江省佳木斯市 154000

中耳膽脂瘤是一種具有破壞性的非癌性病變，以角化鱗狀上皮異常生長為特性[1]，由囊性成分、基質和基質周組織組成。中耳膽脂瘤最重要和最具破壞性的特征是進行性的骨質破壞，造成一系列顱內外并發癥。中耳膽脂瘤的骨質破壞機制主要有破骨細胞(Osteoclast，OC)活化、壓力壞死、酸溶解、酶介導、炎癥介質作用等[2]。大多數研究認為，在中耳膽脂瘤的骨質破壞過程中，OC起到終末功能細胞的作用，破骨細胞活化因子(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)在OC的激活和成熟過程中起著尤為關鍵的作用[2]。有研究表明，蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A，PP2A)可通過激活RANKL誘導的NF-κB信號通路，促進OC的生成和相關表達[3]。多項研究還證明，PP2A的異常表達與多種溶骨性疾病密切相關，如假體周圍骨溶解、肺癌及乳腺癌等。故本文選取PP2A來作為切入點，分析與膽脂瘤骨質破壞存在的聯系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 30例膽脂瘤組標本取自2019年9月—2020年10月我院耳鼻咽喉科行乳突根治術或中耳探查術患者。其中男13例，女17例，年齡22～64歲，平均年齡49.83歲，病程6個月～50年。所選患者術后均病理診斷為中耳膽脂瘤。同時，手術中取15例患者耳后切口處正常皮膚作為對照組，其中男7例，女8例，年齡22～64歲，平均年齡45.27歲，病程6個月～50年。依據Hamed評分法將膽脂瘤組分為骨破壞組16例(得分≥4分)和未破壞組14例(得分0～3分)。

1.2 試劑 兔抗人PP2A單克隆抗體，免疫組化實驗PV-8000-Vision試劑盒，DAB顯色試劑盒。

1.3 主要方法

1.3.1 石蠟切片制備：所有標本取材后2h內固定(10%的中性福爾馬林溶液)，脫水(梯度乙醇)，透明(二甲苯)，浸蠟，包埋；放置于4℃恒溫冰箱中冷藏待用。后期使用切片機以4μm厚度切片；烤片，制得石蠟切片。

1.3.2 免疫組織化學：將石蠟切片浸入二甲苯脫蠟，再浸入梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗，PBS液沖洗；檸檬酸高溫高壓修復3min，待切片自然冷卻后，PBS沖洗；3%過氧化氫去離子水孵育15min，PBS沖洗；放濕盒畫圈(保持不干片，邊畫邊用PBS液沖洗)，甩干擦凈后滴加山羊血清，室溫孵育30min，傾去，勿洗；滴加一抗(工作濃度為1∶100)，放入37℃烤箱2h；取出切片置于室溫10min后 PBS沖洗；滴加二抗，室溫孵育20min，PBS沖洗；滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下控制背景，顯色3min左右；放入蒸餾水中終止染色，用自來水充分沖洗；蘇木素復染15min，自來水沖洗；分化，自來水沖洗5min；返藍(EDTA液)10min；自來水沖洗，行梯度乙醇脫水，烤片，二甲苯透明，中性樹膠封片。上述步驟中用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，以排除非特異性著色。

1.4 結果判定 將膽脂瘤上皮和正常耳后皮膚上皮層分為基底層、 顆粒層、 棘細胞層與角質層。以細胞中出現棕黃色顆粒且染色強度高于背景非特異性染色者為陽性標準。評分方法：先按染色強度計分，0分為無染色，1分為弱棕黃色，2分為中等強度棕黃色，3分為深棕色；然后每張切片在400倍顯微鏡下隨機選取5個不重疊視野進行陽性細胞計數，每個視野計數100個細胞，計算5個視野的陽性細胞的平均百分比，按照百分比計分，沒有細胞著色為0分，<20%細胞著色為1分，21%≤細胞著色≤50%細胞著色為2分，>50%細胞著色為3分；兩項得分結果相加后分為四級：0、1為(-)，2為弱陽性(+)，3為陽性(++)，≥4為強陽性(+++)。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計分析軟件對所得的實驗數據進行分析，陽性率的比較采用χ2檢驗，等級資料的差異用秩和檢驗，P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PP2A在膽脂瘤組和對照組的表達情況 膽脂瘤組中PP2A分布于中耳膽脂瘤上皮全層，無明顯強弱趨勢，主要表達于細胞核，少數表達于細胞膜、細胞質(見圖1)，陽性表達以強陽性和中陽性居多，陽性率為83.3%。而在對照組中PP2A多為陰性表達(見圖2)，陽性率僅為26.7%。兩組間差異具有統計學意義(χ2=11.650，P<0.01)，見表1。

圖1 PP2A在中耳膽脂瘤中的表達(IHC ×400) 圖2 PP2A在正常皮膚中表達(IHC ×400)

表1 膽脂瘤組和對照組PP2A的表達

2.2 PP2A在骨破壞組及未破壞組中的表達情況 骨質破壞組和未破壞組PP2A表達水平見表2，16例骨破壞組中PP2A表達強陽性者有10例，而14例未破壞組中僅有1例PP2A強陽性表達，骨破壞組中PP2A表達水平較未破壞組明顯增強，兩組間差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

表2 骨破壞組和未破壞組PP2A的表達

中耳膽脂瘤其危險性主要是對骨質的廣泛破壞。研究表明，破骨細胞的浸潤程度與中耳膽脂瘤的骨質破壞程度呈正相關，破骨細胞在骨質破壞過程中作為末端效應細胞，通過RANKL誘導的NF-κB信號通路而被激活[4]。

近年來，多項研究表明，PP也參與了膽脂瘤的形成。在體外實驗中發現，PP2A不僅參與了細胞增殖及凋亡、蛋白質翻譯及翻譯后修飾、癌基因轉化等細胞活動過程，還和腫瘤等多種疾病的發生發展有關[5]。Wang等[3]研究發現，PP2A在人假體周圍膜和鼠鈦顆粒誘導的骨溶解模型中高度表達，抑制PP2A表達可通過強烈阻斷RANKL誘導的NF-кB信號通路抑制破骨細胞生成和破骨細胞相關表達，減輕骨質破壞。Okamura H等[6]研究發現，在體外培養基中，PP2A可通過調節成骨細胞中RANKL的表達參與破骨細胞形成。另外，Ricarte FR等[7]在體外實驗中發現甲狀旁腺激素及其類似物可通過PP2A信號調節成骨細胞中RANKL的表達。

本文結果顯示，與正常耳后皮膚相比，PP2A在中耳膽脂瘤上皮呈現中高表達。此外，筆者通過對中耳膽脂瘤骨破壞組和未破壞組PP2A表達水平的統計學分析發現，PP2A在膽脂瘤上皮骨破壞組中陽性表達要高于未破壞組，這說明PP2A很有可能參與了中耳膽脂瘤的骨質破壞過程。結合以往的研究與本實驗的結果筆者推測，在中耳膽脂瘤中，PTHrP高表達可能是引起PP2A高表達的原因之一。此外，PP2A水平的升高可能引起了RANKL的高表達，激活了NF-κB信號通路，促進OC的生成和相關表達，導致膽脂瘤周邊的骨質受到破壞。另外，多項研究證明，PP2A是一種腫瘤抑制因子，其表達降低或失活是腫瘤轉化的特征[6]。

綜上所述，PP2A在中耳膽脂瘤中高表達并且極有可能參與了膽脂瘤骨質破壞的過程，為研究中耳膽脂瘤骨質破壞機制提供了新的方向，為今后在中耳膽脂瘤中PP2A的研究奠定一定基礎，同時，對研發膽脂瘤臨床治療藥物有一定的意義。