小麥莖基腐病病原鑒定及其對殺菌劑的敏感性測定

李月嬌 孫淑琴 霍建飛 馬浩軒 史碩 楊秀榮 李亮

摘要：為了解天津小麥莖基腐病的發(fā)生情況，本試驗分別在天津市薊州區(qū)、寶坻區(qū)、武清區(qū)、靜海區(qū)和北辰區(qū)5個小麥主栽區(qū)采集莖基腐病害樣品33份，分離真菌菌株204個。經致病性測定、形態(tài)學觀察及對rDNAITS的分子檢測，最終確定為5類病原菌，分別為小麥根腐離蠕孢（Bipolarissorkiniana）、假禾谷鐮刀菌（紫紅色、黃色，Fusariumpseudograminearum）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti），優(yōu)勢菌株為假禾谷鐮刀菌，占分離病原菌總數的74.5%。5類病原菌對8種殺菌劑的敏感性測定結果表明，咯菌腈、丙硫菌唑和咪鮮胺對蠕孢菌的抑制效果最好，咯菌腈、咪鮮胺和多菌靈對鐮刀菌的抑制效果最好。

關鍵詞：小麥莖基腐病;分離與鑒定;殺菌劑;敏感性測定

小麥是我國三大主要糧食作物之一，年產量約占主要糧食作物總產量的20%[1]。近年來，由于氣候變暖、秸稈還田導致的土壤中病原菌的積累，以及耕作制度演變等諸多因素的影響，小麥莖基腐?。╳heatcrownrot）的發(fā)生與危害不斷加重和蔓延[2，3]。小麥莖基腐病可造成小麥減產約35%，嚴重時導致部分田塊絕收，威脅小麥的生產[4-6]。

小麥莖基腐病是一種由多種病原菌復合侵染引起的土傳性真菌病害，在小麥的各個生育期均可發(fā)生[2，7-9]。在中國，由陳厚德于1996年首次報道該病害在江蘇省發(fā)生，隨后河南、河北、山東、安徽和陜西等小麥主產區(qū)也報道小麥莖基腐病的發(fā)生，對我國小麥種植業(yè)造成極大影響[8，10-14]。小麥莖基腐病至少可由16種以上的鐮刀菌侵染引起，已報道致病菌有禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）、假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum）、木賊鐮刀菌（F.equiseti）、三線鐮刀菌（F.tricinctum）和層出鐮刀菌（F.proliferatum）。其中假禾谷鐮刀菌在中國黃淮和西北地區(qū)被報道為引起小麥莖基腐病的優(yōu)勢菌株，其田間發(fā)病率可達70%[8，9，15-17]。此外，小麥根腐離蠕孢（Bipolarissorkiniana）也是導致小麥莖基部變褐的主要病原菌之一[18]。

天津市小麥年栽培面積在10～12萬公頃之間，主要集中在武清區(qū)、寶坻區(qū)、靜海區(qū)、薊州區(qū)和北辰區(qū)。據調查，近年來天津市小麥莖基腐病發(fā)生普遍，嚴重地塊引起死苗、死蘗，減產30%以上。為了明確天津地區(qū)小麥莖基腐病的病原菌組成及優(yōu)勢菌株，本試驗開展了病原菌的分離、致病力測定、rDNA-ITS的分子鑒定等研究，結合形態(tài)特征，鑒定得到5類病原菌，優(yōu)勢菌株為假禾谷鐮刀菌。此外，小麥莖基腐病在小麥各個生育期均可發(fā)病，目前尚未選育出能有效抵抗該病害的小麥品種，當前對該病害仍以化學藥劑防控為主[15，19-21]。因此本試驗采用菌絲生長速率法測定了5類病原真菌對8種殺菌劑的敏感性，以期為小麥莖基腐病的高效防治提供參考。

1材料與方法

1.1小麥莖基腐病害樣品采集

自天津市薊州區(qū)、寶坻區(qū)、靜海區(qū)、武清區(qū)、北辰區(qū)5個小麥種植區(qū)共采集33份小麥莖基腐病病害樣品。

1.2病原菌的分離

采用組織分離法[22]：首先用無菌水將小麥病株根莖部沖洗干凈，吸干水分后將病健交界處組織剪成長寬約為4mm的小塊，采用5%次氯酸鈉溶液對病塊組織表面消毒3min，隨后用無菌水漂洗，置于滅菌濾紙上晾干后轉移至PSA平板，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

1.3致病力測定

以小麥“津農6號”為測試材料，剪下植株同一部位葉片，用75%乙醇進行表面消毒，并將葉片分成兩組，一組用滅菌牙簽刺穿葉片后將5mm菌餅貼于傷口處，另一組直接將菌餅緊貼于小麥葉片上，每組重復3次，每重復3片葉，將其放置于25℃、濕度100%的人工氣候箱內培養(yǎng)48h后調查發(fā)病情況。

1.4病原菌分子鑒定

將分離菌株在PSA平板培養(yǎng)3d后，刮取少量菌絲，采用擎科生物科技有限公司生產的2×T5DirectPCRKit進行PCR擴增。采用通用引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′（上海生工生物工程技術服務有限公司合成）擴增目標片段[23]，擴增體系：模板DNA2μL，引物（10μmol/L）各2μL，2×T5DirectPCRMix25μL，ddH2O補足至50μL。擴增程序：98℃預變性3min;98℃變性10s，61℃退火10s，72℃延伸30s，共35個循環(huán);72℃延伸5min，4℃保存。隨后將PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并將電泳后有明顯單一條帶的PCR產物送至擎科生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI基因庫進行BLAST比對，確定病原菌種類。采用軟件MEGA5.05進行ClustalW比對，以鄰近相接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]。

1.5化學藥劑

針對鐮刀菌及蠕孢菌兩大類病原菌，選擇目前農業(yè)生產上常用的8種化學藥劑：97.2%戊唑醇原藥（天津市華宇農藥有限公司）、96.0%苯醚甲環(huán)唑原藥（一帆生物科技集團有限公司）、97.0%咪鮮胺原藥（武漢能仁醫(yī)藥化工有限公司）、98.0%惡霉靈原藥（天津市綠亨化工有限公司）、97.0%多菌靈原藥（湖北萬業(yè)醫(yī)藥有限公司）、95.0%福美雙原藥（河北冠龍農化有限公司）、97.0%丙硫菌唑原藥（天津市華宇農藥有限公司）、95.0%咯菌腈原藥（瑞士先正達作物保護有限公司）。

1.6毒力測定

采用菌絲生長速率法測定。分別準確稱取以上化學藥劑原藥，每種原藥加入1mL丙酮和10μL吐溫80溶解，加入無菌水配成母液。將計算好的一定量（根據預試驗得出的抑菌率為10%～80%時的藥劑濃度范圍）的藥劑加入50℃左右的PSA培養(yǎng)基中，充分振蕩混勻后，傾入直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，每個濃度重復3～4次，以加無菌水的平板為空白對照。用接種針將待測菌株的菌餅分別移入不同濃度的含藥培養(yǎng)基平板上，正面向下（每皿一餅），置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后調查菌落直徑。以藥劑濃度的對數值為X，抑菌率的機率值為Y，求出藥劑的毒力回歸方程Y=a+bX和相關系數，并計算有效中濃度EC50值。

2結果與分析

2.1小麥莖基腐病田間癥狀

于2021年4月25日小麥分蘗期和6月9日小麥灌漿期自天津市薊州區(qū)、寶坻區(qū)、靜海區(qū)、武清區(qū)、北辰區(qū)5個小麥種植區(qū)，共采集小麥莖基腐病害樣品33份。病株癥狀如圖1所示，苗期癥狀：葉片變黃，植株莖基部1～2節(jié)變褐;成熟期癥狀：白穗，莖節(jié)或根部變褐，早衰死亡。

2.2小麥莖基腐病病原菌分離結果

33份小麥莖基腐病害樣本中共分離到204株病原真菌。根據菌落顏色、生長速度和孢子形態(tài)等指標將204株病原菌歸類為A、B、C、D、E五類菌群。如表1所示，B類菌株的檢出率最高，共分離出102株，分離頻率為50.0%;C類和A類菌株次之，分別得到50株和44株，分離頻率分別為24.5%和21.6%;D類和E類菌株的檢出率較低，分別分離到6株和2株，占分離病原菌總數的2.9%和1.0%。A類菌株主要分布在北辰區(qū)，極少數來源于薊州區(qū)和寶坻區(qū);B類菌株在天津市5個區(qū)均有分布;C類菌株除北辰區(qū)和靜海區(qū)外，其余3個區(qū)均有分布;D類菌株在薊州區(qū)、寶坻區(qū)和北辰區(qū)有分布;E類菌株僅在寶坻區(qū)分離到。以上結果表明引起天津小麥莖基腐病的優(yōu)勢致病菌為B類菌株，且該菌株在5個區(qū)均有分布。

2.3病原菌形態(tài)學鑒定

A類菌株：在PSA平板上產生白色氣生菌絲，較繁茂，菌落顏色隨培養(yǎng)天數的增加逐漸加深，直至呈灰綠色或黑綠色。分生孢子長橢圓形或長梭形，直或彎曲，黑褐色，有分隔，以5～7隔居多。初步鑒定，該菌株為小麥根腐離蠕孢（Bipolarissorokiniana），屬半知菌亞門離蠕孢屬真菌（圖2A）。

B類菌株：在PSA平板上產生大量白色絮狀氣生菌絲，菌落背面成紫紅色，隨培養(yǎng)天數的增加顏色逐漸加深。大型分生孢子呈鐮刀形，頂胞較尖呈鳥嘴狀，3～7個隔膜，3個隔膜居多，分隔明顯（圖2B）。

C類菌株：在PSA平板上產生大量白色絮狀氣生菌絲，菌落背面成黃色，隨培養(yǎng)天數的增加顏色逐漸加深。大型分生孢子呈鐮刀形，頂胞較尖呈鳥嘴狀，3～7個隔膜，3個隔膜居多，分隔明顯（圖2C）。

D類菌株：在PSA平板上產生短羊毛狀氣生菌絲，菌落呈紫紅色，后期菌落正面長有少部分黃色菌絲并呈環(huán)狀分布，背面呈深紫紅色。大型分生孢子細長且直，呈線形，1～3個隔膜（圖2D）

E類菌株：在PSA平板上產生致密平坦的絮狀氣生菌絲，菌落初期為白色至粉色，后逐漸變?yōu)橥咙S色。大型分生孢子呈鐮刀狀，細長彎曲，頂細胞細長且基細胞足跟比較明顯，3～7個隔膜（圖2E）。

2.4致病力測定

病原菌對小麥葉片的侵染結果如圖3所示，5種真菌對小麥葉片均具有致病力。病原菌A在有傷口的情況下可快速侵染小麥葉片組織并蔓延，而在沒有傷口時，未見有明顯侵染，表明傷口對其侵染起重要作用;病原菌B、C、D和E有無傷口對其侵染無明顯影響，濕度較大時均能成功侵染并蔓延生長，尤其是B和C菌株生長速度極快，引起小麥葉片組織的黃化和腐爛;菌株D的致病性較弱（圖3）。

將接種發(fā)病的小麥組織表面消毒后，重新在PSA平板上進行病原菌分離，均分離到對應的接種病原菌，表明分離到的5種真菌均為致病菌。

2.5病原菌分子生物學鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

基于形態(tài)學觀察結果，初步鑒定菌株B、C、D和E屬于鐮刀菌屬。為進一步明確上述4種病原菌，對菌株B～E的rDNA-ITS序列進行PCR擴增，凝膠電泳結果（圖4）顯示，4株菌的PCR產物在500～750bp之間均有一條明亮且單一的條帶，測序結果顯示菌株B～E擴增片段大小分別為581、586、610、597bp。將測序結果與NCBI基因庫中已發(fā)表的鐮刀菌rDNA-ITS序列進行比對，菌株B和C的rDNA-ITS序列與已報道的假禾谷鐮刀菌（F.pseudograminearum，ID：MH333075）序列高度相似，相似性分別為99.28%和99.10%;菌株D為燕麥鐮刀菌（F.avenaceum，ID：KT963799），其rDNAITS序列與已報到的序列相似性為99.32%;菌株E為木賊鐮刀菌（F.equiseti，ID：MH054915），其序列相似性達99.47%。

由系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）可知，4株致病菌聚為兩個大的分支，MH681156等13個序列與菌株B、C和E的序列聚在一起，KT963799等9個序列與菌株D的序列聚為另一個分支。菌株B和C與假禾谷鐮刀菌的序列以98%的支持率聚在一起，菌株D與燕麥鐮刀菌以97%的支持率匯聚為一個子分支，菌株E與木賊鐮刀菌以99%的支持率匯聚為一個子分支。

2.6化學藥劑的毒力測定

由表2可知，針對小麥根腐離蠕孢菌，多菌靈和惡霉靈的EC50值最高，分別為97.2477mg/L和77.7393mg/L，表明離蠕孢菌對上述兩種殺菌劑不敏感，單獨使用這兩種藥劑不能有效防控小麥莖基腐病;其他6種藥劑對離蠕孢菌的抑制活性較高，EC50值為0.0704～16.9555mg/L，其中咯菌腈、丙硫菌唑和咪鮮胺的抑制效果最好，福美雙的抑制效果較弱。供試殺菌劑對離蠕孢菌的殺菌活性順序為咯菌腈>丙硫菌唑>咪鮮胺>戊唑醇>苯醚甲環(huán)唑>福美雙>惡霉靈>多菌靈?？┚?、丙硫菌唑、咪鮮胺、戊唑醇可作為對由離蠕孢菌引起的小麥莖基腐病化學防治的候選殺菌劑。

8種殺菌劑對4種鐮刀菌的毒力測定結果如表3所示，8種藥劑在一定濃度下對4種鐮刀菌均表現出抑制作用，且隨濃度的增加，抑制效果更為明顯。不同藥劑對鐮刀菌的EC50值不同，其中咯菌腈和咪鮮胺的EC50值最小，多菌靈次之;咯菌腈的EC50值分布在0.0704～0.8678mg/L之間，咪鮮胺的EC50值在0.0627～7.9713mg/L之間，多菌靈的EC50值在0.2732～14.1241mg/L之間，表明上述3種殺菌劑對4種鐮刀菌均具有極強的抑制活性。其他5種殺菌劑對鐮刀菌的抑菌活性相對較弱。上述8種殺菌劑均可作為對由鐮刀菌引起的小麥莖基腐病化學防治的候選殺菌劑，其中咯菌腈、咪鮮胺和多菌靈的防治效果最佳。

3討論與結論

近年來，小麥莖基腐病在中國小麥各主產區(qū)頻繁發(fā)生，嚴重威脅小麥生產。本研究從采自天津5個主要小麥種植區(qū)的33份小麥樣品中共分離到真菌菌株204個，分為5個菌群，通過形態(tài)學鑒定和基于rDNA-ITS的分子鑒定，確定為小麥根腐離蠕孢菌、假禾谷鐮刀菌（紫紅色、黃色）、燕麥鐮刀菌和木賊鐮刀菌。其中假禾谷鐮刀菌檢出率達74.5%，在天津5個區(qū)均有分布;離蠕孢菌的分布次之，檢出率為21.6%，絕大部分來源于北辰區(qū)。不同地區(qū)病原菌的種類存在差異，引起天津地區(qū)小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌為假禾谷鐮刀菌，其次為小麥根腐離蠕孢。

明確病原菌的組成及致病性的差異，對制定防治策略和指導抗病育種具有重要意義。本試驗結果表明，假禾谷鐮刀菌比小麥根腐離蠕孢的致病力更強，離蠕孢菌僅在有傷口時快速侵染小麥組織并蔓延，而在沒有傷口時未發(fā)生侵染，表明傷口是其侵染所必須的。相反，有無傷口對鐮刀菌菌株的致病性沒有影響，只要濕度充足，病原菌都能侵染小麥組織并蔓延生長，尤其是假禾谷鐮刀菌生長速度極快，引起小麥組織的黃化和腐爛。

在采樣的過程中發(fā)現當小麥長勢弱或受到傷害（除草劑、缺素癥等）時會加重病害的發(fā)生。此外，已發(fā)病的田塊當澆水不當導致土壤濕度過高，或者因地塊不平出現的低洼區(qū)域發(fā)病情況較重。但是，當小麥種子進行包衣處理后，發(fā)病程度較不進行種子包衣的田塊減輕[25-27]。因此，建議小麥在播種前進行種子處理，且優(yōu)先選用咯菌腈和咪鮮胺，并根據當地病原菌組成搭配使用多菌靈和丙硫菌唑，避免抗藥性的產生。