豬鏈球菌2型分離鑒定及其對小鼠的致病性分析

劉娜 于江 李建達 張玉玉 楊靈芝 任素芳 叢雁芳

摘要：為了解豬鏈球菌2型菌株對昆明小鼠的致病性，并建立其感染昆明小鼠模型，本試驗分別取2頭疑似患鏈球菌病的病死豬腦組織、血液分別涂布于含5%胎牛血清的TSA固體培養基中進行細菌分離;并對分離獲得的細菌進行形態觀察、PCR鑒定、藥物敏感性試驗、小鼠致病性試驗及組織病理切片觀察。結果顯示，分離菌為革蘭氏陽性短鏈球菌，經PCR鑒定為豬鏈球菌2型，命名為LY株;藥敏試驗證實LY株對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環丙沙星、諾氟沙星敏感，對四環素、多粘菌素B、克林霉素不敏感;LY株對小鼠致死劑量為2.2×109cfu/只;組織病理切片觀察發現小鼠肺臟、脾臟及心肌均出現不同程度的病變。本研究明確了山東省豬鏈球2型毒株的毒力，為疫苗候選菌株的篩選提供了理論依據。

關鍵詞：豬鏈球菌2型;分離鑒定;小鼠;致病性

豬鏈球菌（Streptococcussuis）2型是一種能夠引起人獸共患的病原菌，臨床上主要引起豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥和突發死亡等癥狀[1，2]。根據豬鏈球菌莢膜抗原的多樣性，可將豬鏈球菌分為35個血清型（1～34型及1/2型）[3，4]，其中主要致病血清型為1、2、7、9型[5，6]。1998年夏季在江蘇省部分豬群暴發豬鏈球菌2型疾病，對人畜健康造成嚴重威脅[7]。2005年夏季四川省暴發豬鏈球菌2型疾病，造成人員傷亡[8]。該菌是一種革蘭氏陽性菌，在自然界分布廣泛，不僅可以引起豬，還可以引起人、馬、牛、羊、禽等多種動物感染[9]。人感染豬鏈球菌與職業有密切關系，但未見人與人直接傳染的報道[10]。該病多呈地方性流行，一年均可發生感染，但多暴發于4～11周齡的豬群[11，12]。

本研究于2019年從山東省某豬場送檢的具有后肢跛行劃水樣癥狀的2頭40日齡發病仔豬中分離并鑒定出豬鏈球菌2型菌株，通過藥物敏感性試驗確定其對藥物的敏感性。由于豬體試驗周期長、操作不方便、費用高、免疫抑制病等在攻毒試驗中常常影響結果[13]，而小鼠作為動物模型費用低、操作簡易，因此本研究采用昆明小鼠建立豬鏈球菌2型LY株感染動物模型，以確定臨床分離株豬鏈球菌2型LY株致死劑量及毒力。

1材料與方法

1.1病料來源

病料采集于2019年山東省某豬場送檢的臨床癥狀疑似豬鏈球菌2型的2頭40日齡發病仔豬，臨床表現后肢跛行，死前有劃水樣癥狀。

1.2試驗動物及主要試劑

昆明小鼠，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司;TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker等，購自寶生物工程（大連）有限公司;TSA培養基、TSB培養基，購自美國BD公司;藥敏紙片，購自OXOID公司;鏈球菌細菌生化編碼鑒定管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3細菌的分離純化

取病死豬血液、腦組織分別劃線接種于含5%胎牛血清的TSA培養基，37℃培養18h，挑取菌落，進行革蘭氏染色鑒定。繼續傳至第三代，挑取單菌落接種于7mL含5%胎牛血清的TSB培養基，37℃搖床180r/min培養8h。

1.4菌液PCR鑒定

取100μL菌液進行PCR鑒定，以CPS2J基因特異性引物（表1）進行擴增[14]，擴增目的片段為124bp。菌液PCR反應體系（25μL）：10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5μL，dNTPs2.0μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，無菌水15μL，DNA模板3μL。PCR反應程序：95℃預變性10min;95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，34個循環;72℃延伸10min。反應結束后，取5μLPCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

1.5生長曲線及OD600值與其活菌數相關性曲線的建立

挑取單菌落，接種于含5%胎牛血清的TSB培養液中，37℃搖床180r/min培養12h，作為種子液。取種子液1mL，加入99mLTSB培養液中，37℃、180r/min培養，分時取菌進行活菌計數和吸光度OD600的測定，建立生長曲線及OD600值與其活菌數的相關性曲線。

1.6藥敏試驗

采用藥敏紙片法檢測該細菌對臨床常用青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環丙沙星、諾氟沙星、四環素、多粘菌素B、克林霉素共9種藥物的敏感性，具體試驗方法按照說明書進行操作。

1.7攻毒菌液制備

挑取豬鏈球菌2型LY株凍干粉劃線接種于TSA平板（5%胎牛血清），置于37℃培養箱中培養18～20h，作為F1代。挑取F2代單菌落，密集劃線于TSA平板（5%胎牛血清），37℃培養14h，沖洗菌體后，根據吸光度OD600與活菌數的線性關系，計算菌液濃度，并稀釋至所需濃度。

1.8小鼠致病性試驗

將40只昆明小鼠隨機分為4組，每組10只，其中3組分別腹腔注射1.1×1010、1.1×109、1.1×108cfu/mL不同梯度菌液0.2mL，另一組作為空白對照，腹腔注射PBS0.2mL，攻毒后連續觀察7d。

1.9組織病理切片觀察

分別將小鼠的心臟、脾臟、肺臟經4%甲醛溶液固定后，按照常規包埋，制備石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察。

2結果與分析

2.1發病仔豬剖檢結果

2頭發病仔豬均表現為間質性肺炎，并有纖維素性滲出，心肌內膜黏連，關節積液，胸腔積液，脾梗死（圖1）。

2.2細菌形態特征

在含有5%胎牛血清的TSA平板上生長出大量透明、光滑、圓潤的小菌落。挑取疑似菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察顯示為革蘭氏陽性菌，呈鏈狀（圖2）。

2.3PCR鑒定

取100μL菌液進行PCR鑒定，擴增條帶與目的條帶大小一致（圖3）。

2.4生長曲線及OD600值與活菌數的相關性曲線的建立

2.4.1生長曲線的建立 如圖4所示，豬鏈球菌2型LY株在TSB培養基中培養3h左右開始進入對數生長期，6～8h達到高峰，8h后活菌數逐漸下降，進入衰退期。

2.4.2活菌數與OD600值相關關系的建立 根據分時測定的活菌數和OD600值，在細菌生長遲緩期和對數期，活菌數和OD600值呈線性關系（圖5），相關性表示為y=24.6590x-1.0761（R2=0.9967）。

2.5藥敏試驗

藥敏試驗結果（表2）顯示，分離菌株LY株對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環丙沙星、諾氟沙星敏感，對四環素、多粘菌素B、克林霉素不敏感。

2.6小鼠致病性試驗

小鼠致病性試驗結果顯示試驗組小鼠表現出不同程度的精神萎靡，被毛糙亂。感染劑量為2.2×109cfu/只小鼠在24h內全部死亡;2.2×108cfu/只攻毒組在48h死亡4只;2.2×107cfu/只攻毒組在48h死亡1只;對照組小鼠狀態良好（表3）。將死亡的小鼠剖檢，取肺臟劃線接種于TSA平板（5%胎牛血清），分離的細菌經形態觀察、PCR鑒定，證明為豬鏈球菌2型菌株。

2.7組織病理切片觀察

組織病理切片結果顯示，肺部血管發生玻璃樣變，血管壁增厚，肺泡腔中可見淡粉色漿液滲出（圖6A）;脾臟紅髓區域淋巴細胞大量減少，組織中還可見較多圓形空腔，空腔中有嗜堿性顆粒物（圖6B）;心肌纖維間隙增寬，血管擴張，充滿紅細胞（圖6C）。

3討論與結論

豬鏈球菌是一種具有莢膜的革蘭氏陽性菌，其中2型為35個血清型中最常見且毒力最強的血清型[15]。豬鏈球菌自然感染的部位為豬的上呼吸道，尤其是扁桃體和鼻腔[16]。

近年來，隨著豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）和豬圓環病毒病（PCV）等免疫抑制性疾病的流行，導致豬鏈球菌病2型感染率上升，然而對豬鏈球菌2型的生長特性卻鮮有報道[17]。本研究從發病仔豬的肺部病灶分離菌株，經細菌形態學和PCR鑒定為豬鏈球菌2型。通過液體培養的方法對豬鏈球菌2型LY株的生長曲線及OD600值進行測定，結果顯示，豬鏈球菌2型LY株在TSB液體培養基（含5%胎牛血清）中37℃培養3h后進入對數生長期，在8h后進入衰減期。

豬鏈球菌2型的毒力、致病性和免疫性一直是研究者十分關心的問題，目前已有豬鏈球菌2型感染模型的報道[18-20]。本研究選用昆明小鼠作為動物試驗模型，用分離的LY株進行攻毒，小鼠出現精神抑郁、食欲下降、死亡等癥狀，感染劑量為2.2×109cfu/只時小鼠死亡率為100%。對死亡小鼠進行組織病理切片觀察，分別在肺臟、脾臟和心肌中發現不同程度的病變。

豬鏈球菌作為一種典型的革蘭氏陽性菌，對各種抗菌藥的抵抗力并不強。但由于日常生產中抗生素的濫用，導致大量耐藥菌株的出現。通過藥敏試驗發現，本研究分離到的豬鏈球菌2型菌株對多粘菌素B和克林霉素完全耐藥，對四環素輕度耐藥，而對青霉素、紅霉素、氯霉素、苯唑西林、環丙沙星、諾氟沙星敏感。本研究結果與鄧智丹[21]、劉澤文[22]、徐引弟[23]等研究結果不完全相同，說明抗生素的普遍使用，造成臨床上菌株的耐藥性差異，進一步驗證了在豬鏈球菌的防治過程中，藥敏試驗的重要性與必要性。

綜上所述，本研究建立了豬鏈球菌2型生長曲線，明確了該菌的生長特性和毒力，為疫苗候選菌株的篩選提供了理論依據。