商丘地區番茄枯萎病病原菌分離與鑒定

孫景梅 朱曉琴 盛亞楠 裴冬麗

摘要：本試驗以河南省商丘地區患枯萎病番茄植株為試材，采用組織分離、形態觀察及ITS序列分析，對引起番茄枯萎病的病原菌進行鑒定。結果表明，病原菌菌落呈圓形、白色，中心呈淡紫色，分生孢子鐮刀狀或橢圓狀。經PCR擴增番茄病原菌ITS序列后得到長度為582bp的片段，對該序列在NCBI中進行比對，顯示與尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）同源性達99%以上。綜合形態特征和序列比對結果，確定該病原菌為尖孢鐮刀菌。將該病原菌回接到健康番茄植株上，引起番茄枯萎癥狀與田間一致。

關鍵詞：商丘市;番茄枯萎病;分離;鑒定;尖孢鐮刀菌

番茄因其營養物質豐富，味道鮮美，加工方式多樣，受到世界各國的喜愛。在中國，番茄栽培范圍廣、種植面積大，呈集約化栽培趨勢。但番茄的集約化種植使病害發生愈加頻繁[1]。番茄枯萎病是由枯萎病菌引起的一種維管束疾病，是一種嚴重危害番茄品質和產量的土傳性病害，從番茄幼苗期到成株期均可侵染[2]。尤其連作及設施生產中該病害的發病幾率更高，常在開花期侵染番茄莖基部造成維管束堵塞、植株萎蔫枯死，現已成為影響番茄栽培面積擴大和效益提升的重要病害之一[3]。據統計，發病危害嚴重的大棚減產達30%～50%，已成為設施番茄安全生產的主要瓶頸[4]。本試驗以河南省商丘市平臺鎮千禧番茄為研究對象，通過對病原菌進行形態觀察和ITS序列擴增對其進行鑒定[5]，以期為培育抗番茄枯萎病材料提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試植株為河南省商丘市平臺鎮千禧番茄。PDA培養基，在高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20mi

1.2試驗方法

1.2.1番茄枯萎病的田間發病癥狀 于2019年和2020年的5—6月在河南省商丘市平臺鎮千禧番茄大棚內對番茄枯萎病的發生情況進行調查，每隔6d觀察一次，直至全株發病枯死。

1.2.2番茄枯萎病病原菌的分離與純化 病原菌的分離采用植物組織分離法[6，7]。首先將患病組織在75%乙醇中消毒20s，取出后用無菌水沖洗3次，再用5%次氯酸鈉消毒5min，無菌水漂洗5次。使用最后一次漂洗的水進行涂布判斷是否滅菌徹底。在超凈工作臺中用滅菌鑷子將處理過的患病組織塊（約5mm2）平鋪于PDA培養基上，每個培養基4塊。于27℃培養箱內倒置培養1周，觀察菌株生長情況。待菌落長出后采用單孢分離法進行純化[8，9]。

1.2.3番茄枯萎病病原菌形態觀察 在進行單孢分離后，得到菌株的單菌落，觀察和記錄菌落的形態、分泌物及顏色變化;顯微鏡下觀察孢子形狀大小、有無分隔等。

1.2.4番茄枯萎病病原菌的DNA提取及ITS序列擴增 采用改良的CTAB法[10，11]提取番茄枯萎病病原菌的總DNA，利用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′擴增菌株ITS基因片段。反應體系（20μL）：DNA2μL，ITS11μL，ITS41μL，dNTP1.6μL，10×PCRBuffer2μL，ddH2O11.9μL，Taq酶0.5μL。反應條件：94℃預變性3min;94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共35個循環;72℃延伸10min。PCR產物送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。1.2.5 病原菌的致病性檢測 病原菌在PDA液體培養基中培養7d，制備孢子懸浮液，將孢子濃度調至106個/mL左右。選取長勢一致的健康植株采用葉片噴灑法[12]接種病原菌，空白對照噴灑清水。25℃培養并注意保濕，觀察植株發病狀況。

2結果與分析

2.1番茄枯萎病癥狀

一般在番茄花期開始發病，發病初期番茄植株下部接近地面的葉片變黃，隨著發病時間的延長患病葉片發黃直至枯萎，少部分植株會出現一側葉片發病一側正常的現象，大多植株都是除了最頂端幾片葉正常外，其余葉片從下往上慢慢發病并發黃枯萎、但不會脫落，與曹俊庫[13]的結果一致。

2.2番茄枯萎病病原菌菌落及孢子特征

本試驗分離到多株病原菌，選取一株有代表性菌株進行后續試驗，命名為FQ-1。培養8d時，從培養基正面看FQ-1菌落呈白色絮狀，圓形，菌落邊緣為稀疏的白色菌絲，邊緣不整齊，向四周呈放射狀生長（圖1A）。從培養基背面看，菌落四周呈白色，中心則呈淡紫色，邊緣不平整（圖1B）。

病原菌孢子呈不同形狀及大小，大孢子鐮刀狀，內部有0～3個橫向隔膜，小孢子呈橢圓形（圖1C、D）

2.3番茄枯萎病病原菌分子鑒定結果

PCR擴增ITS基因序列總長度為582bp，擴增產物測序后在NCBI核酸序列數據庫中進行同源序列比對，結果表明擴增序列和尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）的序列（登錄號：KP942940.1）相似性達99%、覆蓋率為100%。依據中國真菌志（第三十八卷）[14]，結合菌株形態特征，確定商丘地區番茄枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌。

2.4番茄枯萎病病原菌的致病性檢測

培養1周時接種后的植株陸續發病，且發病癥狀和田間枯萎病癥狀相同（圖2B～F），而對照生長正常（圖2A）。表明導致番茄枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌。

3討論與結論

植物真菌性枯萎病是一種毀滅性土傳病害，主要致病菌為尖孢鐮刀菌，其寄主范圍廣泛，可侵染100多種植物[15，16]，有“植物癌癥”之稱[17，18]。該病原菌從植株根部侵入，侵染性極強[19]，是世界范圍內許多作物的重要致病菌，因此病原菌的準確鑒定對防控作物枯萎病意義重大[20]。

本試驗以河南省商丘市平臺鎮采集的發病番茄植株為試驗材料，采用組織分離法對病原菌進行分離，并通過形態觀察和分子測序對其進行鑒定。結果表明，引起番茄枯萎病的致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）。對該致病菌的基因組信息有待進一步研究，另外，本試驗主要在實驗室中進行，為了試驗結果的準確性，后續需在大田中作進一步研究，對所分離的病原菌生理生化特性進行分析，并篩選出相應拮抗菌，結合生產過程中棚內濕度調節、合理通風、合理輪作等措施有效預防番茄枯萎病的發生。