蝦青素對脂多糖（LPS）誘導奶牛子宮內膜細胞凋亡的影響

張相倫 靳青 趙紅波 劉曉牧 劉桂芬 張冬梅 譚秀文

關鍵詞：蝦青素;子宮內膜細胞;凋亡;線粒體;Fas/FasL通路;脂多糖（LPS）

子宮內膜炎是牛場常見的繁殖障礙性疾病，多發于產后，如果治療不及時或治療不當可造成產后第一次發情延遲、配種成功率和妊娠率降低，嚴重者導致不孕，給奶牛養殖業造成巨大的經濟損失。已有研究證實，致病菌感染是導致該病最重要的因素，這些致病菌在母牛分娩后由子宮頸口入侵至子宮內膜層，進而引起炎癥反應[1，2]。目前，臨床上針對子宮內膜炎的治療以抗生素為主，但藥物殘留引發的食品安全隱患以及耐藥菌株的不斷出現使得治療效果愈發不明顯，因此，開發新的抗生素替代品迫在眉睫。

研究發現，炎癥反應誘發細胞凋亡，使機體正常的組織結構受到嚴重損傷。Monack等[3]報道，沙門氏菌和志賀氏菌感染巨噬細胞，造成促炎級聯反應和細胞凋亡。Zhang等[4]報道，金黃色葡萄球菌可產生多種毒素，引起細胞凋亡;在某些疾病例如特異性皮炎和敗血癥中，金黃色葡萄球菌誘導的細胞凋亡會影響疾病的嚴重程度和預后結果。Bhadaniya等[5]利用病毒、細菌等病原微生物感染人子宮內膜上皮細胞，發現炎癥因子IL-6、IL-8和TNF-α表達水平升高，細胞凋亡比例升高，說明病原微生物導致細胞發生炎癥反應，進而引起細胞凋亡。因此，針對子宮內膜炎的防治有必要從抗凋亡角度入手尋找合適的藥物或添加劑。

蝦青素（astaxanthin，AST）是一種酮式類胡蘿卜素，廣泛存在于海洋生物、藻類、真菌及少數植物中[6]。研究發現，蝦青素具有多種生物學效應，尤其在抗凋亡方面具有重要作用[7]，迄今為止使用蝦青素抗炎癥誘導細胞凋亡的報道非常少。因此本研究利用已成功構建的奶牛子宮內膜細胞炎癥模型[8]，分別從內源性和外源性兩種凋亡途徑探討蝦青素在抵御炎癥誘導的子宮內膜細胞凋亡方面的作用，為其在炎癥預防和治療方面的應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要試劑 胎牛血清（FBS）、三抗混合液（BiologicalIndustries）;血清白蛋白（BSA）、蝦青素（Sigma）;DMEM/F12培養基、脂多糖（LPS）、0.25%Trypsin-EDTA（Gibco）;引物（濟南博尚生物技術有限公司）;FasL酶標試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）;AnnexinV凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）;TRIzonReagent（北京康為世紀生物科技有限公司）;HiscriptⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）、ChamQTMSYBRColorqPCRMasterMix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）

1.1.2主要儀器 倒置相差顯微鏡及全自動顯微攝像裝置（Nikon）、流氏細胞儀（BD）、高速冷凍離心機（Eppendorf）、酶標儀（美國伯騰）、CO2細胞培養箱（Thermo）、熒光定量PCR儀（羅氏）、化學發光凝膠成像系統（Invitrogen）。

1.2試驗方法

1.2.1細胞培養及分組處理 奶牛子宮內膜細胞系購自美國ATCC細胞庫，按說明書要求進行復蘇并繼續培養。待細胞貼壁80%～90%時用胰酶消化，加入含10%胎牛血清、1%三抗的DMEM/F12培養液調整細胞密度為1×104個/mL，置于38℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內培養。待細胞貼壁80%～90%后，隨機分為4組：對照組（CK組）、脂多糖組（LPS組）、蝦青素保護組（LPS+AST組）和蝦青素組（AST組），每組6個重復。具體操作為：棄培養液，LPS組加入終濃度為1μg/mL的LPS培養液作用6h，之后更換為新鮮培養液;LPS+AST組加入終濃度為1μg/mL的LPS培養液作用6h，之后更換為含1μmol/LAST的培養液;AST組加入新鮮培養液作用6h，之后更換為含1μmol/LAST的培養液;CK組加入新鮮培養液作用6h，之后再次更換為新鮮培養液。

1.2.2酶標儀檢測 在酶標板孔中分別加入100μL標準品或待測樣品，每孔加入100μL酶結合物工作液，37℃避光孵育60min，洗板5次;每孔加入100μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60min，洗板5次;加入100μL顯色底物，37℃避光孵育15min;最后加入100μL終止液，酶標儀測定450nm處吸光度，經空白校準后繪制標準曲線并計算每個樣品的蛋白濃度。

1.2.3細胞凋亡檢測 待測細胞培養板用PBS液洗兩次，加入胰酶37℃消化5min，待大部分細胞脫落時加入含10%FBS的細胞培養液輕輕吹打，收集細胞懸液到1.5mL離心管中，300×g離心5min，去掉上清液，加入195μL緩沖液輕輕重懸細胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC并輕輕混勻，室溫避光孵育10min，再加入10μLPI染液輕輕混勻，室溫避光孵育5min，立即流式細胞儀上機檢測并利用WinMDI2.9軟件計算細胞凋亡率。

1.2.4熒光定量RT-PCR 利用Primer5.0軟件設計PCR引物（表1）。

利用試劑盒進行細胞總RNA提取，通過A260和A280比值和瓊脂糖電泳檢測RNA純度和完整性。采用反轉錄試劑盒進行cDNA合成，-20℃保存備用。熒光定量RT-PCR反應體系（μL）：SYBRPremix10μL、上下游引物各1μL、cDNA模板2μL、ddH2O6μL。擴增條件：95℃30s;95℃10s，60℃30s，共40個循環;95℃15s，60℃60s，95℃15s。設置內參β-actin表達量作為參照，采用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。20

1.2.5WesternBlot 細胞用預冷的PBS洗兩次，加入蛋白裂解液反復吹打，收集裂解液4℃高速離心吸取上清液;將所有樣品的總蛋白濃度調至1mg/mL;向樣品中加入緩沖液，混勻后置于水中煮沸5min，使蛋白質變性;制備5%濃縮膠和12%分離膠，將蛋白樣品加入點樣孔中，濃縮膠和分離膠電泳電壓分別為90V和120V;70V電壓下轉膜30min;將PVDF膜取出置于含3%BSA的TBST中室溫封閉1h;取出將PVDF膜置于一抗中4℃過夜，TBST洗膜;將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液室溫孵育2h，TBST洗膜;取出PVDF膜，加入化學發光液室溫避光孵育2min，使用凝膠成像系統拍照并進行灰度分析，計算蛋白相對表達量。

1.3數據分析

采用SPSS19.0軟件的ANOVA進行分析，數據先經LSD轉換后進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

2結果與分析

2.1蝦青素對子宮內膜細胞凋亡的影響

利用流式細胞儀檢測子宮內膜細胞凋亡比例，結果（圖1）發現，LPS作用6h導致細胞凋亡比例顯著升高（P<0.05）;加入蝦青素作用24h后，細胞凋亡比例顯著下降（P<0.05）。說明蝦青素可降低LPS誘導的子宮內膜細胞凋亡。

2.2蝦青素對子宮內膜細胞凋亡相關基因表達的影響

利用熒光定量RT-PCR檢測Bax、Bcl-2、Fas、Caspase8、Caspase3基因的mRNA表達水平，結果（圖2）發現，與CK組相比，LPS處理顯著提高子宮內膜細胞Bax、Fas、Caspase8、Caspase3基因的mRNA表達水平（P<0.05），降低Bcl-2基因的mRNA表達量（P<0.05）;加入蝦青素作用后Bax、Fas、Caspase8、Caspase3的mRNA表達量顯著低于LPS處理組（P<0.05），Bcl-2的mRNA表達量顯著高于LPS組（P<0.05）。說明蝦青素通過線粒體途徑和Fas/FasL途徑抑制LPS誘導的子宮內膜細胞促凋亡相關基因在mRNA水平上的表達。

2.3蝦青素對子宮內膜細胞凋亡相關基因蛋白表達的影響

利用WesternBlot法檢測Bax、Bcl-2、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達水平，利用酶標儀檢測培養液中FasL含量。結果（圖3）發現，與CK組相比，LPS處理顯著提高子宮內膜細胞Bax、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達水平以及培養液中FasL含量（P<0.05），降低Bcl-2蛋白表達水平（P<0.05）;加入蝦青素后Bax、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達量以及FasL含量顯著低于LPS處理組（P<0.05），Bcl-2蛋白表達量顯著升高（P<0.05）。說明蝦青素通過線粒體途徑和Fas/FasL途徑抑制LPS誘導的子宮內膜細胞促凋亡相關基因在蛋白水平上的表達。

3討論與結論

蝦青素作為自然界存在的一種高度活性的化合物，具有增強機體局部和全身免疫的能力，抵抗機體炎癥，這種抗氧化性與免疫調節特性相結合[8]，降低機體組織發生細胞凋亡，在防止疾病發生與傳播中發揮重要作用。Yoshihisa等[9]利用紫外線誘導HaCaT角質形成細胞發生凋亡，蝦青素處理降低誘導型一氧化氮（iNOS）、環氧合酶（COX）-2蛋白和mRNA表達水平，抑制角質形成細胞凋亡，降低TNF-α、IL-1β和巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）的蛋白質和mRNA表達水平。Lin等[10]發現蝦青素預處理可能通過維持氧化還原平衡并抑制鈣內流和內質網應激，顯著降低谷氨酸誘導的神經細胞活性喪失和細胞凋亡。Zhang等[11]在小鼠腹腔內注射蝦青素然后注射LPS，發現蝦青素顯著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細胞因子水平以及JAK/STAT3活性，說明蝦青素通過靶向JAK/STAT3介導的凋亡和自噬信號通路抑制急性胰腺炎造成的胰腺損傷。Xu等[12]研究發現，利用碘海醇處理大鼠的腎小管上皮細胞造成急性腎臟損傷，蝦青素處理提高SIRT1表達水平，下調促凋亡蛋白P53和Bax的表達水平以及上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，降低凋亡細胞數量，從而對腎小管上皮細胞起到保護作用。Sj等[13]報道，蝦青素預處理保護抗凋亡缺陷菌株釀酒酵母免受乙酸和過氧化氫誘導的細胞死亡。Xue等[14]利用大鼠口服蝦青素，然后構建冠狀動脈微栓塞模型，結果發現蝦青素預處理激活Nrf2/HO-1信號通路抑制氧化應激，阻止冠狀動脈微栓塞誘導的心肌細胞凋亡并改善大鼠的心臟功能障礙。本研究利用已成功構建的子宮內膜細胞體外炎癥模型[8]，發現LPS作用6h導致細胞凋亡比例升高，加入蝦青素處理后凋亡比例顯著下降，說明蝦青素可降低LPS誘導的子宮內膜細胞凋亡。

細胞凋亡在真核細胞生物的穩態和發育中起重要調節作用。目前已經發現信號通路主要有兩種，即線粒體介導的內源性通路和死亡受體介導的外源性通路，其受大量促凋亡和抗凋亡分子的調控。線粒體是參與能量代謝的細胞器，在信號轉導、能量轉化和細胞凋亡中發揮重要作用[15]。研究發現，Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡中線粒體途徑的主要參與者。細胞受到外界刺激后，促凋亡蛋白Bax寡聚化并在線粒體外膜中形成大孔，導致凋亡因子（如細胞色素c）釋放到細胞質中，進而啟動凋亡信號級聯反應[16]。相比之下，Bcl-2家族的抗凋亡蛋白阻止Bax寡聚化，協助它們重新易位到細胞質中，從而保持線粒體完整性并抑制細胞凋亡[17]。本研究中LPS誘導的子宮內膜細胞炎癥模型，Bax在mRNA和蛋白水平上表達均升高，Bcl-2表達量降低;蝦青素作用24h后，Bax表達降低而Bcl-2表達升高。說明蝦青素通過調控線粒體介導的Bcl-2家族促凋亡和抗凋亡蛋白水平保護子宮內膜細胞免受LPS誘導的凋亡損傷。

另一種凋亡途徑是外源性凋亡途徑，該途徑由位于細胞表面的膜受體與對應的配體結合啟動，激活細胞凋亡的信號級聯反應。研究發現，Fas是細胞凋亡級聯反應最重要的上游信號分子，配體FasL與Fas的死亡域結合啟動細胞凋亡[18]。FasL可以作為膜分子或作為哺乳動物細胞表面的可溶性分子存在[19]。多項研究表明，Fas存在于正常哺乳動物胸腺[20]、心臟[21]、肝臟[22]、肺[23]、睪丸[24]和其他組織，而FasL存在于大網膜[25]、睪丸[26]、胎盤[27]和其他器官中。Fas相關蛋白死亡域（FADD）、Fas、FasL和Caspase8形成死亡誘導信號復合物（DISC），促進Caspase8激活。本研究中，LPS誘導的子宮內膜細胞Fas、FasL和Caspase8的轉錄和蛋白表達水平升高;蝦青素處理后降低了LPS對子宮內膜細胞造成的凋亡損傷。因此，蝦青素不僅通過線粒體介導的凋亡途徑，還通過Fas/FasL凋亡途徑的關鍵蛋白調控細胞凋亡。

Caspase3激活是觸發細胞凋亡關鍵且不可逆事件。Caspase3的非活性前體Pro-Caspase3存在于細胞質中，當細胞發出死亡信號時，這種前體轉化為活性異二聚體。許多研究表明，Caspase3被各種刺激激活，包括受體介導的Caspase8激活、Caspase9激活、凋亡蛋白Bax和Bcl-2表達改變以及活性氧等[28，29]。本研究中，蝦青素顯著抑制LPS誘導的子宮內膜細胞Caspase3活性。由于Bcl-2家族蛋白和Fas死亡受體在Caspase3表達和激活的調節中起關鍵作用，因此Caspase3水平下降可能是蝦青素能夠抑制抗凋亡Bcl-2蛋白下調以及Fas/FasL關鍵蛋白上調。

本試驗表明，蝦青素通過調控線粒體介導的內源性和Fas/FasL介導的外源性凋亡途徑中促凋亡因子和抗凋亡因子的表達，抑制LPS誘導的子宮內膜細胞凋亡。本研究首次報道了蝦青素對奶牛子宮內膜細胞抗凋亡作用的可能機制，但僅限于細胞范圍，因此后續需要臨床研究來評估蝦青素是否可應用于奶牛子宮內膜炎的防治。