一種5,5′,6,6′-四氯-1,1′-3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物的合成方法

程少冰, 張曉梅

(1. 中國科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)研究所,四川 成都 610041; 2. 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

5,5′,6,6′-四氯-1,1′-3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物也稱JC-1,廣泛應(yīng)用于檢測線粒體膜電位[1-3]。在線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成聚合物(J-aggregates)后可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時(shí),JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時(shí)JC-1為單體,可產(chǎn)生綠色熒光[4-8]。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來衡量線粒體去極化的比例,因此JC-1具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本文利用易獲得的廉價(jià)原料1,2,4-三氯-5-硝基苯為起始物,經(jīng)過乙胺親核取代、芳硝基氯化亞錫還原、雜環(huán)化以及分子駢合最終獲得JC-1(Scheme 1)。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker-300 MHz型核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))。

溶劑除特別說明外均為國產(chǎn)市售分析純試劑。

1.2 合成

(1) 4,5-二氯-N-乙基-2-硝基苯胺(2)的合成

將1,2,4-三氯-5-硝基苯1(88 g, 0.39 mol)溶解在乙胺水溶液(220 mL)中,直接在油浴45 ℃中回流反應(yīng)2 h(反應(yīng)0.5 h左右有黃色固體析出)。反應(yīng)完畢,趁熱過濾,濾餅用水洗滌,烘干得化合物2(86.9 g, 95%);1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ: 8.27(s, 1H), 7.89(brs, 1H), 6.95(s, 1H), 3.27～3.36(m, 2H), 1.35～1.40(m, 3H)。

(2) 4,5-二氯-N1-乙苯-1, 2-二胺(3)的合成

將4, 5-二氯-N-乙基-2-硝基苯胺2(47 g, 0.2 mol)和SnCl2(226 g, 1.0 mol)溶解在乙醇(350 mL)中,回流反應(yīng)過夜。減壓蒸除大部分乙醇,剩余物倒入大燒杯中,加入水(80 mL)和碳酸鈉,直至無氣泡產(chǎn)生。用二氯甲烷(3×100 mL)萃取,合并有機(jī)相,用無水硫酸鈉干燥,濃縮,殘余物冷凍得深綠色固體3(22.8 g, 56%);1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ: 6.73(s, 1H), 6.68(s, 1H), 3.5～3.52(brs, 1H), 3.05～3.15(m, 2H), 1.22～1.37( m, 3H)。

(3) 5,6-二氯-1-乙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑(5)的合成

向4, 5-二氯-N1-乙苯-1,2-二胺3(20.5 g, 0.1 mol)加入乙醚(100 mL),攪拌下將溶于乙醚(100 mL)的乙酸酐(9.5 mL, 0.1 mol)緩慢滴加到反應(yīng)液中,滴加過程中產(chǎn)生灰白色固體,反應(yīng)過夜。停止反應(yīng),過濾,母液旋干,固體用二氯甲烷和石油醚重結(jié)晶得到灰白色固體。向灰白色固體中加入甲苯(100 mL)以及對(duì)甲苯磺酸(1.7 g, 0.01 mol),于110 ℃回流反應(yīng)過夜。停止反應(yīng),冷卻至室溫,有白色固體析出。過濾,母液旋干得到固體,用二氯甲烷(100 mL)溶劑,并用1 N氫氧化鈉溶液(3×50 mL)洗滌,用無水硫酸鈉干燥,濃縮,殘余物用二氯甲烷和石油醚重結(jié)晶得到灰白色固體5(15.5 g, 68%);1H NMR(300 MHz,CDCl3)δ: 7.74(s, 1H), 7.39(s, 1H), 4.08～4.15(m, 2H), 2.59(m, 3H), 1.38～1.43( m, 3H)。

(4) 5,6-二氯-1,3-二乙基-1-碘-2-甲基-2,3-二氫-1H-苯并[d]咪唑-1-碘化物(6)的合成

將5,6-二氯-1-乙基-2-甲基-1H-苯并[d]咪唑5(23 g, 0.1mol)溶解在乙醇(150 mL)中,然后在室溫下加入碘乙烷(24 mL, 0.3 mol),于100 ℃回流過夜(TLC檢測)。待反應(yīng)結(jié)束,停止加熱并冷卻至室溫,濾出固體,用丙酮(2×30 mL)洗滌,真空干燥得黃白色固體6(30.8 g, 80%);1H NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ: 8.55(s, 2H),4.47～4.54(m, 4H), 2.93(s, 3H),1.34～1.39(m, 6H)。

(5) 2,2,2-三氯-1-乙氧基乙烷-1-醇(7)的合成

將水合乙醛(100 g, 0.61 mol)溶解在無水乙醇(62 mL, 1.05 mol)中,于80 ℃回流反應(yīng)3 h。停止反應(yīng),減壓蒸除溶劑,殘余物冷卻,有白色晶體析出,過濾,濾餅真空干燥得化合物7(92.6 g, 80%);1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 4.85(s, 1H), 3.93～4.03(m, 1H), 3.74～3.85(m, 1H), 1.27～1.33( m, 3H)。

(6)JC-1的合成

將鈉(11.5 g, 0.5 mol)溶解在無水乙醇(200 mL)中,加入化合物6(38.5 g, 0.1 mol),攪拌5 min;加入化合物7(12 g, 0.06 mol),加畢,將反應(yīng)體系置于100 ℃下回流反應(yīng)5 h(TLC檢測)。停止加熱并冷卻至室溫,過濾,固體用甲醇重結(jié)晶得JC-1(18.8 g, 58%);1H NMR(300 MHz, DMSO-d6)δ: 8.02(s, 4H), 7.78～7.87(m, 1H), 5.98(d,J=12.0 Hz, 2H), 4.32～4.34(m, 8H), 1.34～1.39(m, 12H)。

以廉價(jià)易得底物1,2,4-三氯-5-硝基苯為起始底物,經(jīng)過6步克級(jí)反應(yīng),以18%的總收率獲得了線粒體膜電位的熒光探針JC-1,為相關(guān)結(jié)構(gòu)的熒光探針提供了一條便捷、有效的途徑。