Th17/Treg細胞比例、誘導型一氧化氮合酶基因多態性與慢性阻塞性肺疾病患者臟腑虛損的相關性研究*

廖春燕，徐丹，王娜娜

（1. 新疆維吾爾自治區中醫醫院呼吸與危重癥醫學科，新疆烏魯木齊 830099；2.新疆維吾爾自治區中醫醫院中醫臨床研究基地，新疆烏魯木齊 830099）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種慢性氣道炎癥疾病[1]，其特征表現為氣流受限且呈進行性加重，并伴有肺部異常炎癥反應[2]。COPD 患者通常會出現肺通氣和彌散功能障礙，并損害呼吸和循環功能，易導致患者出現呼吸衰竭，嚴重者可導致患者死亡[3]。COPD 在中醫學上屬于“肺脹”“喘證”范疇，久病可累及肺、腎、脾，因此，COPD 穩定期以肺、腎、脾氣血虧虛為主，中醫分型分為肺腎氣虛證和肺脾氣虛證，發病首先在肺部，隨著病情進展，逐漸累及脾腎，晚期累及心臟[4]。臨床研究表明[5]，在COPD 發病及疾病進展中，T 細胞介導免疫應答反應及肺血管系統發揮了重要作用，而誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因多態性與很多心血管疾病相關。因此，探究影響COPD 患者臟腑虛損的相關因素，對臨床加強疾病監測和預防，并及時進行治療干預具有重要價值。目前國內外[6-8]對COPD 的研究大多針對其吸入激素、聯合用藥治療方式及預后等方面，很少研究T 細胞和iNOS基因多態性與COPD 的相關性。因此，本研究對COPD 穩定期患者進行研究，旨在探討輔助性T 細胞17/調節性T 細胞（T helper cell 17/regulatory T cell,Th17/Treg）細胞比例、iNOS基因多態性與COPD 患者臟腑虛損的相關性，為臨床準確判斷患者病情，改善治療效果提供理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2020年1月新疆維吾爾自治區中醫醫院收治的130 例COPD 穩定期患者。根據患者疾病所屬中醫證型，分為肺脾氣虛組67 例和肺腎氣虛組63 例。另選同期該院健康體檢者60 例作為對照組。納入標準：①所有患者均診斷為COPD，且處于穩定期[9]；②中醫辯證分型符合肺脾氣虛和肺腎氣虛型[4]；③不存在意識異常；④年齡60 周歲以上；⑤依從性好。排除標準：①合并肺癌；②伴有免疫、造血系統疾病；③伴有重要臟器嚴重病變或功能障礙；④伴有呼吸衰竭、氣胸、胸腔積液等。研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2 肺功能檢測

所有患者及健康體檢者入院后均采用肺功能檢測儀（MasterScreen，德國耶格公司）檢測用力肺活量（forced vital capacity, FVC）、第1 秒鐘用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second, FEV1）、第1 秒鐘用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in one second to forced vital capacity ratio,FEV1%）。

1.3 血清Th17/Treg細胞檢測

所有受試者均于入院第2 天早晨空腹時采集靜脈血5 mL，將其在室溫下靜置30 min，分層出現血清時，置于離心機中，3 000 r/min 離心10 min 后吸取上層血清，于-80 ℃冰箱內冷凍保存。采用流式細胞儀（型號：BD Accuri?C6，美國BD 公司）檢測血清Th17、Treg 細胞變化。

1.4 iNOS基因檢測

所有患者均于入院后第二天早晨空腹時采集靜脈血3 mL，用乙二胺四乙酸進行抗凝并混勻，儀器采用基因芯片檢測儀（型號：GENEPIX 4000B，美國AXON 公司）、生物芯片識讀儀（型號：BE-2.0，上海百傲科技有限公司）。采用聚合酶鏈反應（PCR）將iNOS 基因片段進行擴增，并將基因芯片與PCR 擴增產物進行混勻雜交，再倒入顯色液，然后將其放置在生物芯片識讀儀上進行檢測，采用Array Doctor 軟件進行圖像分析并生成iNOS 基因多態性基因位點檢測結果。

1.5 觀察指標

①肺功能。②血清Th17、Treg、Th17/Treg 細胞比例。③Th17/Treg 細胞比例與COPD 臟腑虛損的相關性。④iNOS 基因型頻率和等位基因頻率。⑤iNOS 基因多態性與COPD 臟腑虛損的相關性。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或者方差分析；計數資料以構成比或例表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson 法；多因素Logistic 回歸分析相關影響因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組一般資料

3 組性別構成、年齡、體質量指數（BMI）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；肺脾氣虛組和肺腎氣虛組病程比較，差異無統計學意義（P＞0.05），均具有可比性。見表1。

表1 3組一般資料比較

2.2 3 組肺功能的比較

3組FVC、FEV1比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），肺脾氣虛組和肺腎氣虛組患者的FVC、FEV1低于對照組（P＜0.05），肺脾氣虛組患者FVC、FEV1大于肺腎氣虛組（P＜0.05）。3組FEV1%比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組肺功能的比較 （±s）

表2 3組肺功能的比較 （±s）

注：①與肺脾氣虛組比較，P ＜0.05；②與肺腎氣虛組比較，P ＜0.05。

FEV1%0.62±0.33 0.61±0.31 0.84±0.42 1.254 0.062組別肺脾氣虛組肺腎氣虛組對照組F 值P 值n 67 63 60 FVC/L 0.81±0.21 0.68±0.17①1.12±0.15①②5.254 0.017 FEV1/L 0.64±0.13 0.42±0.14①0.82±0.14①②6.547 0.012

2.3 3組血清Th17、Treg及Th17/Treg的比較

3 組Th17、Treg 及Th17/Treg 比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），肺脾氣虛組和肺腎氣虛組患者的Th17、Th17/Treg 高于對照組（P＜0.05），Treg 低于對照組（P＜0.05），肺脾氣虛組患者Th17、Th17/Treg 低于肺腎氣虛組（P＜0.05），Treg 高于肺腎氣虛組（P＜0.05）。見表3。

表3 3組血清Th17、Treg 及Th17/Treg的比較（±s）

表3 3組血清Th17、Treg 及Th17/Treg的比較（±s）

注：①與肺脾氣虛組相比較，P ＜0.05；②與肺腎氣虛組比較，P ＜0.05。

Th17/Treg 2.02±0.73 4.61±1.35①0.52±0.14①②11.325 0.000組別肺脾氣虛組肺腎氣虛組對照組F 值P 值n 67 63 60 Th17/%4.51±1.08 6.42±1.61①1.29±0.45①②9.254 0.005 Treg/%2.56±0.62 1.53±0.54①4.26±1.06①②10.547 0.000

2.4 Th17/Treg 與肺功能、肺脾氣虛、肺腎氣虛的相關性

Pearson 相關分析結果顯示，Th17/Treg 與FVC、FEV1、FEV1%呈負相關（r=-0.407、-0.438 和-0.504，P=0.018、0.015 和0.008），與肺脾氣虛、肺腎氣虛呈正相關（r=0.321 和0.565，P=0.032 和0.009）。

2.5 3組iNOS基因型頻率和等位基因頻率比較

3 組誘導型iNOS 基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），肺脾氣虛組和肺腎氣虛組患者GG 基因型頻率低于對照組（P＜0.05），TT 基因型頻率高于對照組（P＜0.05），T 等位基因頻率高于對照組（P＜0.05）；肺脾氣虛組GG 基因型頻率高于肺腎氣虛組（P＜0.05），TT 基因型頻率低于肺腎氣虛組（P＜0.05），T 等位基因頻率低于肺腎氣虛組（P＜0.05）。見表4。

表4 3組iNOS基因型頻率和等位基因頻率的比較 例

2.6 COPD臟腑虛損的多因素Logistic回歸分析

以臟腑虛損為因變量（1=肺脾氣虛，2=肺腎氣虛），以上述單因素分析中P＜0.05 的變量即FVC（1 = ≥80%，2=＜80%）、FEV1（1=≥50%，2=＜50%）、血清Th17（= ≥5.15%，2 = ＜5.15%）、Treg（1 = ≥1.94%，2 = ＜1.94%）、Th17/Treg（1=≥2.74，2=＜2.74）及iNOS 基因多態性（1 =TT，2 =GT，3 =GG）中P＜0.1 的因素為自變量（其中連續變量的自變量以中位數法轉化為二分類），采用多因素Logistic 回歸分析COPD 臟腑虛損的影響因素，結果顯示，iNOS 基因多態性中TT 基因型是影響COPD 臟腑虛損的獨立危險因素（P＜0.05）。見表5。

3 討論

COPD 是以慢性支氣管炎和肺氣腫為主要臨床表現的呼吸系統疾病[10]，其病理學機制在于肺實質、肺血管及氣道壁出現組織結構損傷，以及慢性炎癥反應，主要臨床癥狀表現為咳嗽、咳痰、氣短或呼吸困難以及喘息胸悶等，直接累及肺部，也可引起全身反應[11]。COPD 穩定期在中醫學上表現為肺脾、肺腎虛損，其中肺腎虛損是COPD 進展到嚴重病癥的標志[12]。因此，對COPD 患者不同臟腑虛損狀態的相關影響因素進行分析有助于及時評估疾病進展及采取治療干預。而臨床研究表明[13]，在多種自身免疫性、慢性感染性疾病免疫調節以及COPD 發病機制中均有Th17、Treg 的參與。另外，臨床研究發現，肺血管系統對COPD 發病也具有重要作用，iNOS 使肺血管阻力維持正常，并且抑制肺動脈重建，因此iNOS 基因多態性對NOS轉錄及表達可能產生影響，從而影響COPD 疾病進展。因此，探究Th17/Treg 細胞比例、iNOS 基因多態性與COPD 患者臟腑虛損的相關性，對臨床準確預測及評估患者病情，選擇合理治療方案，及時干預具有重要臨床意義。

Th17 是一種T 細胞亞群，在自身免疫性疾病和機體免疫反應中均有參與[14]。Treg 在各種免疫細胞亞群中通過細胞間接接觸和分泌抑制性細胞因子T細胞亞群，對機體的免疫反應起到負性調節作用，抑制機體免疫反應和對自身抗原的主動耐受[15]。Th17 與Treg 在功能上具有拮抗效應，維持Th17/Treg 細胞比例的平衡有助于促進免疫穩定和防止炎癥反應的發生[16]。門翔等[17]學者研究發現，COPD患者外周血Th17/Treg 比值與患者肺功能下降具有顯著的相關性，并且肺功能指標FVC、FEV1、FEV1%與外周血中Th17 細胞、Th17/Treg 比值呈負相關。林琳等[18]學者研究發現，COPD 穩定期組患者外周血Th17/Treg 比值顯著高于健康組，且Th17、Treg 和Th17/Treg 與FEV1%/預計值和FEV1%均呈負相關。本研究結果顯示，肺脾氣虛組患者Th17、Th17/Treg 顯著低于肺腎氣虛組，Treg 顯著高于肺腎氣虛組，Th17/Treg 細胞比例與肺功能呈負相關性，與臟腑虛損程度呈正相關，且隨著COPD 臟腑虛損程度加深，相關性顯著增加，表明隨著Th17/Treg細胞比例上升，COPD 患者肺功能降低，臟腑虛損程度加深，原因可能在于COPD 是肺部慢性炎癥反應，隨著疾病進展，由肺脾氣虛進入肺腎氣虛，患者肺功能進一步下降，臟腑虛損程度加重，全身炎癥癥狀也加劇，引起病理性免疫應答，導致Th17 上升，Treg 下降，因此Th17/Treg 細胞比例增加。這與門翔等[17]、林琳等[18]學者研究結論相似。

一氧化氮屬于一類交感神經阻滯劑，對興奮性交感神經元活動以及心臟對交感神經刺激反應具有削弱作用，并且能夠增強心臟對迷走神經刺激的反應，抑制血管平滑肌增生，在多種心血管疾病的發展中均發揮了重要作用[19]。NOS 屬于一種存在于神經元中的同工酶，包括神經型、內皮型和誘導型，在成熟肺中均有產生[20]。吳紀珍等[21]學者研究發現，內皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因G894T 多態性[T∶G：=1.377（95%CI：1.112，1.704）；GT∶GG：=1.397（95% CI：1.179，1.656）；TT+GT∶GG：=1.415（95% CI：1.201，1.668）]多態性均可增加靜脈血栓栓塞癥患病風險，eNOS 基因G894T 多態性與靜脈血栓栓塞癥易感性相關。諸國華等[22]學者研究發現，G894T 的TT 基因型高血壓易感性較GG 基因型更高，eNOS基因多態性與高血壓導致的靶器官損害、急性冠脈綜合征存在相關性，G894T的T 等位基因攜帶者動脈內膜增厚患病率更高。本研究結果顯示，肺脾氣虛組T 等位基因頻率顯著低于肺腎氣虛組，且肺脾氣虛組和肺腎氣虛組均高于健康對照組，提示T 等位基因與COPD 臟腑虛損存在相關性，并且iNOS 基因多態性中TT 基因型是影響COPD 臟腑虛損的獨立危險因素，與COPD 臟腑虛損呈正相關，且隨著COPD 臟腑虛損程度加深，相關性顯著增加，表明iNOS 基因多態性與著COPD 患者臟腑虛損具有明顯相關性，其中TT 基因型能明顯加重患者臟腑虛損程度，原因可能在于iNOS 基因多態性會影響一氧化氮釋放水平，其中TT 基因型患者一氧化氮水平最低。隨著COPD 發生，患者肺功能降低，使得iNOS 功能障礙以及活性降低，導致一氧化氮水平降低，患者體內氧化應激水平增加，進一步加劇患者肺部及全身炎癥反應，并且iNOS 基因多態性通過影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統和激肽系統，使得肺動脈收縮重構，引起肺、脾、腎等臟腑虛損程度進一步加重，這與吳紀珍等[21]、諸國華等[22]學者研究結論相似。

綜上所述，Th17/Treg 細胞比例與iNOS 基因多態性與COPD 患者臟腑虛損均具有明顯相關性，且Th17/Treg 細胞比例隨著患者臟腑虛損進展，呈正相關，并且iNOS 基因多態性中TT 基因型是影響COPD 臟腑虛損的獨立危險因素。