EMIT法檢測(cè)他克莫司全血藥物濃度樣品穩(wěn)定性探討

沈陳軍 閔芳芳 寧 萍 安徽省滁州市第一人民醫(yī)院 藥劑科 心胸外科 39000

他克莫司又叫FK506，是一種結(jié)構(gòu)為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的免疫抑制劑，臨床上主要用于器官移植術(shù)后的抗排異治療，同時(shí)在腎病、風(fēng)濕及免疫調(diào)節(jié)方面也有應(yīng)用[1-3]。由于他克莫司是一種治療指數(shù)窄、副作用明顯的藥物，其療效、毒性與藥物在體內(nèi)的濃度密切相關(guān)，根據(jù)臨床指南等要求腎移植術(shù)后患者需要監(jiān)測(cè)他克莫司全血藥物濃度，并根據(jù)血藥濃度調(diào)整劑量[4-5]。目前檢測(cè)他克莫司全血藥物濃度的方法主要有色譜法和免疫法，其中免疫法應(yīng)用較多[6]。我院使用西門(mén)子Syva生化分析儀的酶放大免疫分析法(EMIT)進(jìn)行檢測(cè)，由于我院有較多院區(qū)，因此檢測(cè)需要固定地點(diǎn)和集中時(shí)間，對(duì)此患者可能會(huì)對(duì)樣品是否及時(shí)檢測(cè)和檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性有一定疑慮。綜合以上原因，現(xiàn)對(duì)患者他克莫司血樣在不同時(shí)間和溫度的存儲(chǔ)條件下進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)，以探討其穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 儀器 Viva-E全自動(dòng)生化分析儀(ELITech Group B.V.)、移液器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司)、XW-80A漩渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、TG16-W高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司)、DW-40L92海爾醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)、BCD-180R榮事達(dá)冷藏冷凍冰箱(榮事達(dá)三洋電器股份有限公司)。

1.2 試劑 他克莫司檢測(cè)試劑包括抗體試劑1、緩沖試劑2、酶試劑3(美國(guó)西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司，批號(hào)：8R019UL-N2)、他克莫司定標(biāo)液(美國(guó)西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司，批號(hào)：8R109UL-M3)、他克莫司質(zhì)控品(More Diagnostics inc.，批號(hào)：290-7310)、樣本萃取液(美國(guó)西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司，批號(hào)：8S079UL-L1)、甲醇為色譜純(南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)：180320919D)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)條件與分組：選取6名患者長(zhǎng)期服用(半年以上)他克莫司藥物，年齡25～60歲患者的血樣，經(jīng)EDTA抗凝后取200μl分別保存在室溫(24℃±1℃)立刻檢測(cè)(0h)、1天(1d)、3天(3d)、5天(5d)和冷藏(5℃±1℃)1周(1w)、2周(2w)和3周(3w)，后采用酶放大免疫分析法(EMIT)對(duì)以上樣品進(jìn)行檢測(cè)。另對(duì)0h檢測(cè)結(jié)束后的前處理樣品上清液分別室溫放置15min和30min后再次檢測(cè)。同時(shí)每次檢測(cè)時(shí)隨行質(zhì)控品測(cè)定。

1.3.2 全血藥物濃度前處理方法：將EDTA抗凝后選取的200μl血樣輕微混勻后分別依次加入200μl甲醇和50μl樣本萃取液，立即充分振蕩勻混，混勻結(jié)束后靜置2min，隨后立即14 000r/min高速離心5min，離心結(jié)束后立即將上清液取出上機(jī)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)錄入Excel 2007，以0h檢測(cè)結(jié)果作為基準(zhǔn)數(shù)據(jù)，與室溫、冷藏和靜置后條件下的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)采用雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)，使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同存儲(chǔ)溫度和時(shí)間后樣品檢測(cè)結(jié)果 EMIT法分別檢測(cè)6名服用他克莫司藥物患者血樣，不同溫度和存儲(chǔ)時(shí)間后檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)明顯改變。樣品室溫0h、1d、3d、5d，范圍RSD 7.00%～20.00%，平均RSD=11.91%，冷藏0h、1w、2w、3w檢測(cè)結(jié)果RSD范圍6.00%～17.00%，平均RSD=11.42%。前處理后室溫放置15min和30min后檢測(cè)結(jié)果RSD范圍5.00%～16.00%，平均RSD=10.50%。具體檢測(cè)值詳見(jiàn)表1。

表1 不同存儲(chǔ)溫度和放置時(shí)間后樣品檢測(cè)結(jié)果情況

將室溫1d、3d、5d檢測(cè)結(jié)果與0h檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)，P1d=0.713，P3d=0.415，P5d=0.909，P值均>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冷藏1w、2w、3w檢測(cè)結(jié)果與0h檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)，P1w=0.962，P2w=0.813，P3w=0.465，P值均>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前處理后室溫放置15min和30min后檢測(cè)結(jié)果與0h檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行雙側(cè)配對(duì)t檢驗(yàn)，P15min=0.542，P30min=0.005，P30min<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 不同存儲(chǔ)溫度和時(shí)間樣品比較結(jié)果 比較0h檢測(cè)結(jié)果與室溫、冷藏和前處理后靜置不同時(shí)間檢測(cè)結(jié)果差值的絕對(duì)值，在室溫保存條件下1d、3d、5d檢測(cè)結(jié)果均有波動(dòng)，放置1d時(shí)相對(duì)波動(dòng)較小，3d和5d結(jié)果波動(dòng)較大。冷藏放置1w和2w時(shí)相對(duì)波動(dòng)較小，3w時(shí)結(jié)果波動(dòng)較大。前處理后上清液分別室溫靜置15min和30min再次檢測(cè)結(jié)果有波動(dòng)，且結(jié)果整體有增大趨勢(shì)。詳見(jiàn)表2。

表2 不同存儲(chǔ)溫度和放置時(shí)間后樣品檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

3.1 不同存儲(chǔ)溫度和時(shí)間對(duì)他克莫司檢測(cè)結(jié)果的影響 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明，檢測(cè)他克莫司全血藥物濃度樣品室溫(24℃±1℃)和冷藏(5℃±1℃)條件下分別可以保存1d和1w，長(zhǎng)時(shí)間室溫或者冷藏保存可能導(dǎo)致結(jié)果的波動(dòng)，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。我院目前血藥濃度檢測(cè)地點(diǎn)為北院區(qū)，南院區(qū)收取血樣后及時(shí)保存在冰箱冷藏，當(dāng)天通過(guò)冷藏冰袋保存轉(zhuǎn)運(yùn)至北區(qū)檢測(cè)，其結(jié)果不會(huì)引起偏差。因此臨床醫(yī)生或患者不必?fù)?dān)心檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有文獻(xiàn)報(bào)道建議他克莫司血樣室溫保存不超過(guò)24h，冷藏條件下不超過(guò)48h，且避光密封保存可進(jìn)一步減少影響[7]。全血樣品前處理后得到的上清液應(yīng)立即上機(jī)檢測(cè)，保存時(shí)間不要超過(guò)15min，根據(jù)測(cè)算同批次上機(jī)檢測(cè)樣品不要超過(guò)30個(gè)，否則可能因上清液中甲醇長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中引起揮發(fā)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏大。如果檢測(cè)樣品過(guò)多，離心后EP管應(yīng)密封保存，當(dāng)上機(jī)檢測(cè)時(shí)再倒出上清液。目前我院使用的是EMIT法西門(mén)子全自動(dòng)生化分析儀，他克莫司全血藥物濃度樣品檢測(cè)時(shí)每批次同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控品檢測(cè)，且根據(jù)質(zhì)控結(jié)果情況定期制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡可能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。

3.2 影響他克莫司檢測(cè)樣品穩(wěn)定性的原因分析 他克莫司是一種來(lái)源于真菌的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，具有選擇性T淋巴細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制作用，是臨床常用的繼環(huán)孢素后另一種免疫抑制劑。由于他克莫司的治療范圍窄，劑量與療效和副作用相關(guān)性明顯，因此需要服用他克莫司的患者定期監(jiān)測(cè)其血藥濃度。EMIT法原理是以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合他克莫司抗體的結(jié)合位點(diǎn)為基礎(chǔ)，樣品中他克莫司與酶試劑中的標(biāo)記的重組酶葡萄糖-6磷酸脫氫酶他克莫司發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)[7]。根據(jù)不同溫度存儲(chǔ)條件下他克莫司樣品檢測(cè)結(jié)果可以看出室溫保存與冷藏保存整體檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)后比較差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍可以看出冷藏保存的整體檢測(cè)結(jié)果RSD值和平均變化幅度均小于室溫保存。因此可以得出溫度對(duì)他克莫司樣品保存后檢測(cè)結(jié)果具有顯著的影響[8-9]。他克莫司在血液中主要結(jié)合在紅細(xì)胞上，且他克莫司在全血與血漿中濃度的比例約為20∶1，血漿中他克莫司與血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)98.8%[10]。由于免疫法檢測(cè)他克莫司全血藥物濃度影響因素較多[11]，例如紅細(xì)胞功能、紅細(xì)胞壓積、內(nèi)源性物質(zhì)、他克莫司代謝產(chǎn)物以及其他可能產(chǎn)生影響的藥物等，且溫度對(duì)以上因素具有顯著影響。具體原因可能是較高溫度時(shí)加速紅細(xì)胞的代謝，導(dǎo)致他克莫司自身降解，同時(shí)血漿游離他克莫司與血漿蛋白結(jié)合增加，紅細(xì)胞破壞影響紅細(xì)胞壓積，最終多種因素導(dǎo)致他克莫司全血藥物濃度檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)[7,12-13]。

3.3 本研究的不足及其他相關(guān)問(wèn)題 由于EMIT法檢測(cè)他克莫司的試劑較昂貴，單個(gè)樣品檢測(cè)需要次數(shù)較多，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本較大，故本次研究選取的樣本量較少。在他克莫司檢測(cè)過(guò)程中，環(huán)境和人員操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定影響[14-15]。由于溫度對(duì)酶反應(yīng)過(guò)程中具有決定作用，因此實(shí)驗(yàn)室溫度在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)該按要求嚴(yán)格控制在24℃左右。實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室溫度不穩(wěn)定或低于24℃時(shí)，可能由于酶反應(yīng)不足，導(dǎo)致結(jié)果偏低的情況。同時(shí)濕度以及光線對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響情況還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探討。他克莫司在前處理過(guò)程中用于提取處理的EP管體積常用有1.5ml和2ml，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1.5ml EP管底部為尖頭，如果操作時(shí)先吸取血樣，再加入甲醇和樣本萃取液，可能出現(xiàn)中下部瞬間沉淀凝結(jié)而底部血樣難以混勻，因此為避免前處理操作誤差，建議使用2ml底部圓形的EP管，可以極大避免以上情況的出現(xiàn)。全血樣本應(yīng)使用EDTA抗凝采血管，不建議使用肝素抗凝，因?yàn)橛锌赡茉趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)小血凝塊，影響檢測(cè)結(jié)果。因此綜合以上情況必須做好室內(nèi)質(zhì)量控制，保證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定與準(zhǔn)確。

綜上所述，EMIT法用于臨床檢測(cè)他克莫司全血藥物濃度具有簡(jiǎn)便快捷、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，適合急診以及大樣本檢測(cè)，但試劑成本較高且實(shí)驗(yàn)過(guò)程及樣品受溫濕度等環(huán)境影響較大。樣品的存儲(chǔ)溫度和時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較大，應(yīng)盡量做到及時(shí)處理檢測(cè)，或短時(shí)間冷藏后檢測(cè)，樣品前處理后上清液應(yīng)立即上機(jī)檢測(cè)，且同批上機(jī)檢測(cè)樣品不能超過(guò)30例，否則可能影響檢測(cè)結(jié)果。