組蛋白H3K27me3對糖尿病腎病小鼠足細胞損傷的作用*

曾啟城 隋曉露 許云鵬 張艾莎 謝婷妃 袁樹珍 鄒杰鋒 李麗香 徐子斌 陳繼紅

廣東醫科大學深圳寶安臨床醫學院 深圳市寶安區人民醫院腎內科，廣東省深圳市 518000

糖尿病腎病(DN)的發病機制包括遺傳因素、糖脂代謝紊亂、血流動力學改變、炎癥反應及氧化應激。足細胞結構及功能改變是糖尿病腎病蛋白尿和腎小球硬化重要病理基礎，是糖尿病腎病進展核心事件。表觀遺傳修飾作為連接高血糖“代謝記憶”與糖尿病腎病的“紐帶”而備受關注。組蛋白甲基化是表觀遺傳修飾的重要方式，受組蛋白甲基轉移酶和組蛋白去甲基化酶調控。組蛋白H3K27me3是一個抑制基因轉錄的關鍵介質；組蛋白去甲基化酶通過減少其靶基因啟動子區域H3K27me3水平，解除對基因的抑制進而增強基因表達[1]。有研究表明，在糖尿病嚙齒動物模型的腎臟中，組蛋白H3K27me3表達下調與糖尿病腎病的病理基因相關[2]。H3K27me3具體作用機制尚不清楚，對恢復H3K27me3表達水平是否與延緩糖尿病腎病進展有關，目前相關報道較少。GSK-J4通過選擇性抑制Jmjd3和UTX，減弱其特異性去掉賴氨酸三甲基化修飾[3]。本研究選用自發性2型糖尿病db/db小鼠，給予GSK-J4，抑制組蛋白去甲基化酶活性，旨在了解H3K27me3是否通過調節Nephrin和Podocin表達，減輕足細胞損傷，延緩糖尿病腎病進展。

1 材料與方法

1.1 動物 選用6周齡自發性2型糖尿病db/db小鼠40只、db/m小鼠20只，均購自美國Jackson實驗室。SPF級動物房恒溫環境標準化飼養2周，實驗前禁食不禁水過夜，經尾靜脈采血，用血糖儀測定小鼠的血糖值≥16.7 mmol/L，符合糖尿病小鼠標準后實驗。將db/db小鼠40只隨機分為GSK-J4干預組(G組，n=20)、糖尿病腎病組(D組，n=20)，將db/m小鼠作為對照組(N組，n=20)。

1.2 分組處理及標本收集 G組予組蛋白去甲基化酶抑制劑GSK-J4(購自MedChemExpress公司) 10mg/kg劑量尾靜脈注射處理，N組、D組給予等體積PBS溶液通過尾靜脈注射。頻率：每3周注射1次(分別在第1周、第4周、第7周注射)，共干預10周。其余時間每天觀察小鼠狀態。在第10周前1d把小鼠放入代謝籠，禁食不禁水過夜。收集24h尿液保存于-80℃冰箱待測尿蛋白含量。取血并進行離心取血漿，凍存于-80℃冰箱待測血糖、血肌酐、尿素氮。分離雙腎置于冰上，取8mm3大小腎組織置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，其余腎組織置液氮中冷凍后以-80℃冰箱保存備用。

1.3 觀察指標

1.3.1一般指標：采用全自動生化分析儀檢測血糖(Glu)、24h尿蛋白(24hUTP)、血肌酐(CR)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 腎組織H3K27me3表達：石蠟切片經脫蠟，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，山羊血清封閉后。滴加1∶50稀釋的小鼠抗H3K27me3抗體(購自美國Cell Signaling Technology公司)，4℃孵育過夜;次日室溫復溫1h，PBS沖洗5min×3次。滴加適量辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗工作液，室溫孵育2h;PBS沖洗5min×3次。二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑顯色5min，蘇木素襯染，蒸餾水浸洗玻片3遍，經梯度酒精和二甲苯脫水透明，晾干覆蓋蓋玻片。

1.3.3 腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達：新鮮腎組織固定、脫水、OCT包埋，8～10μm切片，烤片，置于4%多聚甲醛固定30min，于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，5min/次。經抗原修復，滴加BSA封閉液封閉30min。滴加一抗(1∶25 Nephrin antibody、Podocin antibody，均購自美國Proteintech公司)，于濕盒內4℃孵育過夜；滴加生物素化通用型二抗工作液避光室溫孵育50min。DAPI染液復染細胞核，在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。封片后激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達。

1.3.4 腎臟病理學檢查：取左腎組織用10%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，行HE染色，顯微鏡(型號：Leica EG11504)下觀察。

1.3.5 腎組織足細胞凋亡程度：取腎組織石蠟包埋，切片，脫蠟，水洗，用組化筆在組織周圍畫圈，滴加蛋白酶K工作液修復，滴加破膜工作液覆蓋組織，取TUNEL試劑盒(購自瑞士Roche公司)內試劑加到圈內覆蓋組織，山羊血清室溫孵育30min，切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育15min，DAB顯色，蘇木素復染3min，脫水封片。

1.4 統計學方法 應用SPSS Statistics 19.0統計軟件處理所得數據，數值用均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般指標 db/m小鼠精神狀態良好，血糖未見明顯變化，db/db小鼠隨著實驗進行逐漸出現多飲、多食、多尿、肥胖等癥狀。與N組相比，D組血糖、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與D組相比，G組血糖高、24h尿蛋白定量、尿素氮、血肌酐水平減低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組一般指標比較

2.2 腎組織H3K27me3表達 與N組相比，D組腎組織組蛋白H3K27me3表達減少。與D組相比，G組腎組織組蛋白H3K27me3表達增多，見圖1。免疫組化熒光圖片平均光密度分析顯示，D組Nephrin蛋白較N組表達下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；G組Nephrin蛋白表達量較D組表達增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 腎組織足細胞H3K27me3表達

圖2 腎組織足細胞H3K27me3表達平均光密度分析 與N組比較，#P<0.05；與D組比較，*P<0.05

2.3 腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達 雙重免疫熒光染色及激光共聚焦結果顯示，與N組相比，D組腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達減少。與糖尿病腎病相比，G組腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達增多，見圖3。

2.4 各組小鼠腎組織病理學改變 腎組織光鏡表現；HE染色：與N組相比，D組有腎小球體積增大，毛細血管襻擴張，腎小球系膜細胞增生，系膜區基質增多、增寬，基底膜增厚，腎小管上皮細胞肥大、空泡變性，管腔變窄等腎臟病理改變。與D組相比，G組腎小球體積較小，毛細血管襻擴張，腎小球系膜細胞增生，系膜區基質增多、增寬，基底膜增厚，腎小管上皮細胞肥大、空泡變性，管腔變窄等腎臟病理改變較輕，見圖4。

2.5 足細胞凋亡程度 與N組相比，D組足細胞凋亡程度升高。與D組相比，G組足細胞凋亡程度減輕，見圖5。

3 討論

糖尿病腎病早期就會出現足細胞功能和結構的損傷,進而引起足細胞凋亡及脫落。高糖是導致足細胞損傷的重要因素。在高糖刺激下，細胞會生成大量晚期糖基化終末產物，并在細胞內部不斷聚積。 在晚期糖基化終末產物產生過程中，線粒體還會釋放大量的活性氧類，過量的活性氧類打破機體氧化體系與抗氧化體系的平衡，損傷細胞。氧化應激可直接損傷細胞，誘導足細胞凋亡，最終導致腎小球的硬化和腎功能損傷，是糖尿病腎病進展的核心事件。

Nephrin是一種跨膜蛋白，只表達在腎臟足細胞上。Podocin特異性表達于足細胞的足突膜上，促進Nephri的信號轉導。Nephrin和Podocin等裂孔隔膜相關蛋白分子在足突間構成拉鏈樣結構，共同維持足細胞足突的完整性及裂孔膜的正常功能。足細胞數量、結構或功能完整性與蛋白尿的產生存在相關性[4]。

圖3 腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達

圖4 各組腎臟組織病理學表現

圖5 腎組織足細胞凋亡

表觀遺傳修飾是指非基因序列改變所致基因表達水平的變化，可直接影響靶基因，改變疾病表型，作為對環境信號和病理狀態的應答。表觀遺傳學修飾調控靶器官細胞的基因轉錄過程，導致炎性反應基因及多個相關信號通路活化。表觀遺傳修飾的失調，包括染色質組蛋白修飾和 DNA甲基化，在參與腎病發病機制的基因的表達中發揮著關鍵作用[5]。“代謝記憶模型實驗”表明即使短期暴露于高葡萄糖也會導致NF-κBp65亞基、炎癥基因和氧化應激的表達持續增加，即使恢復到正常的葡萄糖水平后仍然持續存在[6]。這可能是表觀遺傳學修飾模式發生了改變，表觀遺傳修飾調節了腎臟基因的表達。

組蛋白甲基化作為表觀遺傳修飾的重要途徑，參與基因的表達調控、基因印記和X染色體失活，調節胚胎發育、細胞增生和分化，與細胞衰老以及腫瘤發生發展有著密切關系。組蛋白甲基化與基因激活或抑制相關，這取決于修飾的氨基酸殘基和甲基化的程度。組蛋白H3K27廣泛分布于小鼠腎臟組織。組蛋白H3K27me3可由Zeste基因增強子同源物2(EZH2)催化產生。EZH2參與組成多梳蛋白抑制復合物2(PRC2)聚集至啟動子區域，導致靶基因轉錄抑制[7]。Jmjd3和UTX為含有Jumonji C結構域的雙加氧酶，和EZH2作用相反，能特異性去除H3K27me3的甲基，解除轉錄抑制，啟動靶基因表達[8]。組蛋白H3K27通過對甲基化與去甲基化調整，作為一個基因轉錄關鍵介質，引發重要生物學功能。GSK-J4是組蛋白去甲基化酶Jmjd3和UTX高效且特異性強的選擇性抑制劑，通過選擇性抑制Jmjd3和UTX，減弱其特異性去掉賴氨酸三甲基化修飾，上調H3K27me3的表達，對下游炎癥反應、氧化、細胞凋亡和侵襲等基因表達產生抑制作用，減輕糖尿病腎病小鼠足細胞損傷。

本研究中，D組腎組織組蛋白H3K27me3表達水平減少，腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達減少，糖尿病腎病病變程度重，病理改變明顯，足細胞凋亡程度增高。在G組中給予GSK-J4，增加腎組織組蛋白H3K27me3表達水平，可恢復腎組織足細胞Nephrin和Podocin表達，使糖尿病腎病病變程度、病理改變減輕，足細胞凋亡程度減輕。

糖尿病腎病過程中發現組蛋白H3K27me3表達水平下降，其加重糖尿病腎病進展的可能機制：(1)糖尿病腎病病程中，血液中的高糖環境可引起Zeste基因增強子同源物2的消耗，減少了H3K27me3三甲基化，同時使啟動子區域的多梳蛋白抑制復合物2水平下降，減弱了對基因轉錄的抑制作用。使轉錄因子Pax6表達上調并與TXNIP啟動子結合，增加了氧化應激和蛋白尿，誘發了足細胞損傷[9]。(2)非編碼RNA可以與組蛋白賴氨酸甲基轉移酶和組蛋白賴氨酸脫甲基酶結合，使組蛋白去甲基化酶靶向與組蛋白H3K27me3結合，導致組蛋白H3K27me3發生去甲基化[10]。組蛋白H3K27me3水平下調，對下游NF-κB信號通路抑制作用解除。IKK復合體被激活，NF-κB被釋放并進行核易位，在細胞核內與基因編碼上的κB位點結合，通過轉錄酶啟動基因表達程序。多種細胞因子、黏附分子和急性期反應蛋白的基因表達上調，導致足細胞損傷[11]。(3)糖尿病腎病病程中，基因微環境發生改變，組蛋白翻譯后修飾、DNA甲基化和lncRNAs之間發生相互作用和串擾，組蛋白翻譯穩定狀態被破壞，可導致組蛋白H3K27me3發生去甲基化，引起miR-195的表達上調。miR-195通過級聯反應下調凋亡抑制基因Bcl-2的表達，并通過增加caspase-3表達，最終導致足細胞凋亡[12-13]。(4)糖尿病腎病病程中，高糖血癥及基因微環境改變等多重因素作用下，使H3K27me3水平降低。可引起Notch配體Jagged-1表達水平升高。Jagge-1在細胞表面表達，然后通過與Notch1結合啟動旁分泌信號，導致Notch1在細胞膜上的裂解。裂解產物NICD(ICN)進入細胞核，通過RAM域和cdc/ankyrin重復序結合CSL蛋白[CBF1、Su(H)、LAG1]并募集核轉錄激活蛋白家族MAML(mastermind-like)，形成三元絡合轉錄激活物(NICD-CSL-MAML)。通過堿性螺旋—環—螺旋(bHLH)家族轉錄因子表達上調促進下游基因表達，從而促進細胞增殖和抑制細胞分化[14]。給予GSK-J4，提高組蛋白H3K27me3表達水平，可能減輕上述途徑對腎組織足細胞損傷，而延緩糖尿病腎病的進展。

糖尿病腎病過程中，GSK-J4可通過調節組蛋白去甲基化酶活性，增加H3K27me3表達，維護足細胞功能和結構的完整，延緩糖尿病腎病進展。