miR-199-3p過表達調控肺癌A549細胞生長、侵襲及上皮間質轉化機制研究

熊偉杰,王云濤,何 朗

肺癌是發病率和病死率增長最快的惡性腫瘤之一，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，當發生繼發性多器官轉移時，約75%處于疾病晚期[1]。既往文獻報道，肺癌5年生存率僅為5%～10%[2]。在分子水平上，肺癌由一系列遺傳和表觀遺傳學改變引起，這些改變使腫瘤抑制基因失活并激活癌基因[3]。了解肺癌發生發展的分子機制將有助于提高診斷、治療和預防水平。miRNA在包括細胞增殖、細胞凋亡、信號轉導和致癌在內的各種生物學過程中起著關鍵作用[4]。相關研究表明，miR-199-3p抑制肝癌MHCC97H細胞的增殖、遷移[5]，促進骨肉瘤細胞凋亡[6]，抑制膀胱癌細胞增殖[7]。已有研究表明，miR-199a-3p能通過負調控CBX7抑制肺癌A549細胞的發展[8]。本研究旨在探究miR-199-3p靶向SOX5對肺癌細胞A549生長、侵襲能力及上皮間質轉化(EMT)的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 RRPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青-鏈霉素均購自美國賽默飛世爾科技公司；人肺癌A549細胞購自美國典型培養物保藏中心；miR-485-5p模擬物、SOX5過表達載體、SOX5空載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；BCA試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；Transwell購自美國康寧公司；一抗Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin購自英國Abcam公司。

1.2細胞培養 A549細胞于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱用高糖RMPI 1640培養基(含10% FBS和1%青-鏈霉素)培養，取對數生長期細胞用于實驗，0.25%胰蛋白酶消化。

1.3熒光素酶報告實驗 通過生物信息學網站(http://www.targetscan.org/)預測SOX5和miR-199-3p的結合位點，選用熒光素酶報告分析，構建野生型(WT)和突變型(MUT)SOX5 3' UTR熒光素酶報告基因重組質粒轉染至A549細胞。根據試劑盒說明書檢測熒光素酶相對活性。

1.4RT-PCR 收集轉染后的A549細胞，按TRIzol法提取細胞總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA并建立20 μl反應體系，反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃ 10 min。以U6和GAPDH為內參，用2-ΔΔCt方法進行定量計算。

1.5SOX5過表達 將A549細胞按隨機數字表法分為對照組(Control組)、pcDNA組和pcDNA-SOX5組。Control組不作處理，pcDNA組轉染空質粒載體，pcDNA-SOX5組轉染SOX5 pcDNA質粒載體，通過RT-PCR和Western blot測定SOX5 mRNA水平和蛋白表達水平驗證SOX5過表達是否成功。

1.6細胞分組 將細胞隨機分為Control組、miR-199-3p過表達組(mimic組)、SOX5過表達組(SOX5組)和mimic+SOX5組。Control組不做任何處理，mimic組轉染miR-199-3p mimic，SOX5組轉染SOX5 pcDNA載體，mimic+SOX5組同時轉染miR-199-3p mimic和SOX5 pcDNA載體。

1.7克隆形成法檢測細胞增殖 將A549細胞接種于6孔板(500個/孔)，按方法“1.6”分組，待出現肉眼可見的克隆時，多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，顯微鏡下計數克隆形成數計算克隆形成率。

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡率 取轉染后的各組A549細胞接種于6孔板，培養48 h后，室溫下加入5 μl Annexin V-FITC混勻，最后加入碘化丙啶(PI)10 μl避光孵育15 min，檢測細胞凋亡率。

1.9Transwell檢測細胞侵襲情況 于Transwell上室添加無血清培養基稀釋的人工基底膜，取轉染后的各組A549細胞，上室中加入100 μl細胞懸液，下室中加入600 μl含FBS的RMPI 1640培養液。培養24 h后脫脂棉擦掉基質膠和上室細胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min，0.1%結晶紫染色。光學顯微鏡下計數并拍照，每個樣本隨機選取5個視野。

1.10EMT形態學觀察 取各組轉染后A549細胞接種于6孔板過夜培養，顯微鏡下觀察各組細胞形態變化。

1.11Western blot檢測Ki-67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平 各組A549細胞裂解提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白含量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流電轉移至聚偏氟乙烯膜。加入一抗Ki-67(1∶1 000)、PCNA(1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶1000)和Vimentin(1∶1000)4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液清洗后加入辣根過氧化物酶標記的IgG(1∶10 000)，最后發光成像。ImageJ 軟件分析蛋白水平。

2 結果

2.1miR-199a-3p與SOX5靶向關系 與Control組比較，mimic組A549細胞miR-199a-3p mRNA水平升高，SOX5 mRNA水平降低(P<0.05)，見圖1。與SOX5 WT、SOX5 MUT、SOX5 MUT+mimic組比較，SOX5 WT+mimic組熒光素酶活性降低(P<0.05)，見圖2。

圖1 RT-PCR檢測A549細胞miR-199a-3p及SOX5表達水平

圖2 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-199a-3p與SOX5熒光素酶活性

2.2SOX5過表達對SOX5 mRNA和蛋白表達的影響 與Control組比較，pcDNA-SOX5組A549細胞SOX5 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 SOX5過表達對SOX5 mRNA水平和蛋白表達水平的影響

2.3miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞增殖的影響 與Control組比較，mimic組A549細胞克隆形成率降低，SOX5組A549細胞克隆形成率升高(P<0.05)；與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細胞克隆形成率降低(P<0.05)。見圖4。與Control組比較，mimic組A549細胞Ki-67、PCNA蛋白表達水平降低，SOX5組A549細胞Ki-67、PCNA蛋白表達水平升高(P<0.05)；與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細胞Ki-67、PCNA蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖5。

圖4 miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞增殖的影響

圖5 miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞Ki-67、PCNA蛋白表達的影響

2.4miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞凋亡的影響 與Control組比，mimic組A549細胞凋亡率升高，SOX5組A549細胞凋亡率降低(P<0.05)；與SOX5組比，mimic+SOX5組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖6。與Control組比，mimic組A549細胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高，SOX5組A549細胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值降低(P<0.05)；與SOX5組比，mimic+SOX5組A549細胞Bax/Bcl-2比值和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高(P<0.05)。見圖7。

圖6 miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞凋亡的影響

圖7 miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.5miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞侵襲的影響 與Control組比較，mimic組A549細胞侵襲數降低，SOX5組A549細胞侵襲數升高(P<0.05)。與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細胞侵襲數降低(P<0.05)。見圖8。

圖8 miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞侵襲的影響

2.6miR-199a-3p靶向SOX5對A549細胞EMT的影響 Control組A549細胞可見形態為連接松散的類圓或紡錘體樣，黏附力低，細胞由上皮向間質轉化，而mimic+SOX5組EMT形態變化少于SOX5組。提示miR-199a-3p過表達抑制上皮間質細胞轉化。與Control組比較，mimic組A549細胞E-cadherin蛋白表達升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低，而SOX5組A549細胞E-cadherin蛋白表達降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表達升高(P<0.05)。與SOX5組比較，mimic+SOX5組A549細胞E-cadherin蛋白表達升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低(P<0.05)。見圖9。

圖9 miR-199a-3p過表達對A549細胞EMT的影響

3 討論

肺癌在我國發病率和病死率極高[9-11]。隨著分子生物學的發展，新的腫瘤標志物和治療靶點為肺癌的診斷和治療提供了新的方向。SOX5與淋巴瘤、乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌等的發生發展密切相關[12]。SOX5蛋白參與胚胎發育、神經生長、干細胞形成等生長發育過程，是細胞分化的調控者[13]。

本研究發現，miR-199a-3p過表達靶向抑制SOX5具有降低A549細胞Ki-67、PCNA蛋白表達水平的作用。癌細胞的過度增殖是腫瘤發生與發展的重要因素之一。Ki-67和PCNA是與細胞增殖相關的核抗原，近年來被廣泛應用于檢測細胞增殖，PCNA為DNA聚合酶輔助蛋白，與細胞增殖密切相關[14]。Ki-67水平可反映細胞的增殖狀態，其高表達促進腫瘤細胞增殖[15]。張麗娟等[16]研究發現，miR-199a-3p過表達可降低卵巢癌SK0V3細胞的增殖能力。提示miR-199a-3p過表達靶向抑制SOX5可抑制A549細胞增殖。本研究發現，過表達miR-199a-3p靶向SOX5后，A549細胞Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3上調。細胞凋亡屬于程序性細胞死亡，可通過消除舊的及受損細胞維持生物機體內生理平衡，Caspase-3屬于凋亡蛋白，抑制Caspase-3蛋白活性可阻斷凋亡途徑起到抑制凋亡的作用[17]。Bax發揮促凋亡作用，Bcl-2發揮抗凋亡作用，二者相互作用，可形成異源二聚體可調控細胞凋亡[18]。有研究報道，miR-199a-3p可通過抑制視網膜母細胞瘤1誘導類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡[19]。提示miR-199a-3p過表達靶向抑制SOX5可促進A549細胞凋亡。

本研究結果顯示，過表達miR-199a-3p靶向SOX5后，A549細胞侵襲能力降低。陶良俊[20]研究發現，過表達miR-199a-3p可抑制腎癌細胞786-0的增殖、存活和侵襲。QU等[21]研究發現，miR-199a-3p通過靶向Smad1抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲。提示miR-199a-3p過表達靶向抑制SOX5可抑制A549細胞侵襲。

本研究發現，過表達miR-199a-3p靶向SOX5后，A549細胞E-cadherin蛋白表達升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達降低。EMT是發生在傷口愈合和癌變過程中的一種上皮細胞失去其分化表型獲得間質細胞特征的生物學過程[22]。當細胞發生EMT時，E-cadherin下調，N-cadherin和Vimentin表達上調，可用于判斷EMT的發生[23]。提示過表達miR-199a-3p可靶向SOX5抑制A549細胞EMT。

綜上所述，miR-199a-3p表達升高可抑制肺癌A549細胞增殖、侵襲和EMT，并促進細胞凋亡，這可能是通過靶向抑制SOX5表達實現的。以miR-199a-3p為靶點的干預治療有望成為抑制肺癌A549細胞侵襲和增殖的新方法。