miRNA-122、224在肝細胞癌患者肝組織和血清中的表達水平及臨床意義

王海溥 郭俊強 岳愛民

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝細胞或肝內膽管細胞發生癌變導致的疾病，是我國最為常見的消化系統腫瘤。其致死率在所有腫瘤中位列第三，具有惡性程度高、病死率高、預后差等特點[1,2]，且一經發現常為晚期，大多數患者已失去手術治療的價值，而目前針對晚期HCC的治療手段仍為傳統放化療。近年來索拉菲尼用于治療晚期HCC的效果較為顯著[3]，但晚期HCC患者的五年生存率仍低于30%。HCC嚴重威脅我國人民的健康，尋找有效治療HCC的方法十分重要。現階段的許多研究從分子生物學角度入手，探究HCC的發病原因和機制，尋找新的HCC相關靶點，為HCC的臨床治療尋找理論依據。近年來報導的與HCC相關研究多與微小RNA(mircoRNA，miR)相關，有研究表明miR-122和miR-224的表達與HCC的發生、發展和預后密切相關[4,5]。本研究對本院收治的肝癌患者血清和組織中miR-122和miR-224表達水平進行檢測，旨在為HCC的診斷和治療提供新的思路，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇本院肝膽外科2017年3月至2020年3月接受肝臟惡性腫瘤根治術的62例HCC患者作為研究對象，其中男性35例，女性27例納入研究組。納入標準：①術中病例確診為HCC，患者全部符合HCC診斷標準[6]；②患者未接受過放、化療和靶向治療；③流行病學資料和臨床資料完整，包括患者年齡、性別、病理分級、腫瘤直徑等。排除標準：①其他肝臟占位病變；②患者接受過放療、化療和靶向治療；③未在我院接受治療者；④伴有嚴重臟器功能損害患者。選擇同期醫院收治非惡性肝占位病變患者62例，作為對照組其中男性31例，女性31例，收集肝臟組織。研究組患者年齡35～75歲，平均年齡(53.3±4.7)歲；對照組年齡32～71歲，平均年齡(51.6±3.4)歲。本研究納入對象均簽署對研究的知情同意書并經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 肝細胞癌組織中miRNA-122和miRNA-224的檢測

使用Trizol試劑盒(購買自北京天根生化有限公司)提取組織中總RNA，使用Nanodrop儀器檢測RNA樣品質量，OD260/OD280數值>1.8證明所提取RNA質量較好，無污染。提取到的樣品置于-80 ℃保存備用。在總樣品中提取1 μl總RNA進行逆轉錄，使用SuperScript IV Reverse Transcriptase(購買自美國thermofisher公司)逆轉錄試劑盒按照說明書合成cDNA，反應條件為55℃ 10 min，80℃ 10 min針對目標序列使用Primer premier6.0設計引物，由上海生工有限責任公司合成引物。miRNA-122上游引物序列為：5'-CCATACCACCCTGAACGC-3'，下游引物序列為：5'-GTATTCCCAGGCGGTCTC-3'；miRNA-224上游引物序列為：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列為：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；U6引物上游序列為：5'-CGCTTCGGCAGACATATAC-3'，下游引物序列為：5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'。以cDNA作為模板，U6引物作為內參，使用q-PCR技術檢測miRNA-122和miRNA-224在HCC患者和非惡性肝占位病變患者組織中的相對表達情況。建立20 μl反應體系，上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA模板1 μl、dd H2O 7.8 μl、q-PCR Mix反應液10.4 μl。反應條件為92℃預變性5 min，然后92℃ 60 s、54℃ 60 s、72℃ 60 s進行30個循環。反應在PCR儀(HEMA96TC珠海黑馬醫學儀器有限公司)中進行。miRNA-122和miRNA-224相對表達使用2-△△Ct法進行測定。△△Ct=(CTmiRNA-CTU6RNA)實驗組-(CTmiRNA-CTU6RNA)對照組。

1.3 患者血清中miRNA-122和miRNA-224的檢測

采用酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，檢測HCC患者和非惡性肝占位病變患者血清中miRNA-122和miRNA-224表達水平。實驗組與對照組患者均在入院后次日晨起空腹時抽取靜脈血4 ml于抗凝管中，離心制備血清，使用ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)并嚴格按照試劑盒中說明書所示操作步驟，檢測患者血清中miRNA-122和miRNA-224的表達水平。檢測后使用酶標儀檢測其濃度，與標準曲線對比得出檢測結果。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組miRNA-122和miRNA-224水平比較

結果表明：研究組組織中miRNA-122水平為(1.26±0.33)，對照組為(3.65±0.53)，研究組低于對照組(P<0.001)；研究組組織中miRNA-224水平為(4.19±0.41)，對照組為(2.56±0.32)，研究組高于對照組(P<0.001)。

2.2 兩組血清中miRNA-122和miRNA-224水平比較

結果表明：研究組血清中miRNA-122水平為(39.12±4.13)，對照組為(73.65±7.26)，研究組低于對照組(P<0.001)；研究組血清中miRNA-224水平為(74.96±9.58)，對照組為(41.87±3.14)，研究組高于對照組(P<0.001)。

2.3 肝細胞癌組織中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關系

HCC患者組織中miRNA-122低表達和miRNA-224高表達與腫瘤直徑、病理分期、淋巴結轉移和外周血甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)水平相關，差異具有統計學意義(P<0.05)；與患者年齡和性別無關，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 HCC組織中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關系

2.4 肝細胞癌患者血清中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關系

HCC患者血清中miRNA-122低表達和miRNA-224高表達與腫瘤直徑、病理分期、淋巴結轉移和外周血AFP水平相關(P<0.05)；與患者年齡和性別無關(P>0.05)，見表2。

表2 HCC患者血清中miRNA-122和miRNA-224水平與其臨床病理特征的關系

3 討論

HCC是常見的消化系統惡性腫瘤之一。早期HCC患者常無明顯癥狀和體征，難以被發現，大多數患者一經診斷即為中晚期，失去手術的最佳時機。中晚期HCC具有惡性程度高、對傳統放化療不敏感、手術治療后易復發等特點，患者五年生存率較低[7]。外科手術治療是HCC患者早期主要的治療手段，近幾年對腹腔鏡下肝癌切除術的研究和報導逐漸增多，因其創傷小和出血少的優點逐漸代替傳統手術治療[8]。晚期HCC患者的主要治療手段為化療，研究發現經導管肝動脈化療栓塞術(TACE術)和索拉菲尼治療中晚期肝癌的效果優于傳統化療，但患者預后仍較差[9-10]，故HCC的早期診斷在HCC的治療過程中十分重要。

miRNA是一種長度為20～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，之前的研究表明許多miRNA不僅參與人體的正常生命活動，在某些疾病的發生和發展中也起重要的作用[11]。如miR-95的高表達具有促進骨肉瘤的侵襲和轉移，抑制腫瘤細胞的凋亡的作用[12]；miR-9在胃癌細胞中的過表達可以促進胃癌細胞的生長和轉移，抑制腫瘤細胞凋亡[13]；miR-17在乳腺癌組織中高表達通常與患者預后不利良密切相關[14]。本研究中miR-122是一種在肝臟中高表達的miRNA，參與了肝臟的多種生理功能，還具有抑制肝癌細胞增殖和促進其凋亡的作用[15-16]。有研究表明miR-122在HCC組織中表達水平降低，且miR-122的低表達與HCC的復發、轉移和預后不良密切相關[17]。最近研究表明miR-224在直腸癌、非小細胞癌、乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中均有高表達現象，而且miR-224可通過基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)基因調控腫瘤細胞的侵襲和轉移[18-19]。

本研究通過使用q-PCR和ELISA法對研究組62例HCC患者和對照組62例非惡性肝占位病變患者肝臟組織中和血清中的miR-122和miR-224的表達水平進行比較，結果顯示HCC患者肝臟組織和血清中的miR-122水平較非惡性肝占位病變患者相比顯著下降(P<0.001)；而HCC患者肝臟組織和血清中的miR-224水平明顯上升(P<0.001)，比較文獻結果與之前的報導相吻合[20-21]。本研究還發現HCC患者肝臟組織和血清中miR-122的低表達與miR-224的高表達與患者性別和年齡無關(P>0.05)，但和HCC腫瘤直徑、病理分期、淋巴結轉移和外周血AFP水平密切相關(P<0.05)。此研究結果表明，可通過檢測患者血清和肝臟組織中miR-122和miR-224的表達水平對HCC腫瘤大小、病理分期和有無轉移進行初步判斷。

綜上所述，患者血清和肝臟組織中miR-122和miR-224的表達水平與患者年齡和性別無關，但對HCC的腫瘤大小、病理分期和有無轉移具有一定的判斷價值，但其機制尚不明確，有待進一步研究。