幽門螺桿菌感染對胃癌組織miR-146a表達及胃癌惡性進展的影響

常永欣 王 鑫 唐照鵬

胃癌為常見消化道腫瘤，發病率與病死率均較高，目前具體發病機制尚不明確，與遺傳、飲食習慣、消化疾病、幽門螺桿菌感染等因素有關，其中幽門螺桿菌感染為公認的胃癌重要誘因[1-2]。分子生物學顯示胃癌發病與凋亡基因失調、抑癌基因失活、致癌基因激活有關，小分子RNA(miRNA)為相對保守且非編碼的單鏈RNA，經降解mRNA或抑制轉錄能調節基因表達[3-4]。研究顯示[5]，miR-146a可參與免疫反應，對多種腫瘤增殖、轉移、凋亡過程具有一定作用，目前關于miR-146a在胃癌中研究較少[6]。為此，本研究探討了幽門螺桿菌感染對胃癌組織miR-146a表達情況及對胃癌惡性進展的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019年5月至2021年5月我院收治的82例胃癌患者，其中男性49例，女性33例；年齡為38～70歲，平均(49.68±8.71)歲。納入標準：符合《胃癌診治難點中國專家共識(2020版)》標準[7]，且經術后病理檢查確診為胃癌；無幽門螺桿菌根除史；無手術與放化療治療史；簽署知情同意書。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；合并高血壓、糖尿病等慢性疾病患者；嚴重心肝腎功能不全患者；妊娠或哺乳期婦女；精神疾病或意識障礙患者?；颊咝g后進行病理取材，檢測腫瘤類型、大小、分化程度、TNM分期與淋巴結轉移；并對術后切除胃癌組織進行幽門螺桿菌檢測，根據感染情況將患者分為陽性組(n=54例)與陰性組(n=28例)。陽性組男性32例，女性22例；平均年齡為(50.16±9.02)歲。陰性組男性17例，女性11例；平均年齡為(49.72±8.67)歲。2組資料差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺桿菌感染檢測方法 患者檢查前均無抗菌素與制酸藥等服用史，于術后的病理標本切除后取適量胃癌組織及癌旁組織進行檢測，生理鹽水清洗后將組織用改良Giemsa染色玉快速尿素酶試驗法測定幽門螺桿菌，兩試驗均呈陽性則表示幽門螺桿菌感染，反之則無幽門螺桿菌感染[8]。

1.2.2 組織處理 將患者組織標本于手術切除后半小時內常規固定、包埋，制備切片進行HE染色觀察，免疫組化檢測幽門螺桿菌表達。

1.2.3 提取組織標本中RNA 抽提多張組織標本切片，參照說明書進行：(1)取出組織樣品中石蠟，于液氮內研磨后移入離心管，加入二甲苯混合；(2)組織與二甲苯混合后加熱，融化石蠟；(3)室溫下離心2 min，將組織沉淀去除二甲苯；(4)加入乙醇洗滌，室溫下離心除去乙醇，再重復1次洗滌；(5)干燥，沉淀中加digestion buffer與protease混勻，置于50 ℃、80 ℃中15 min，離心后吸取上清液移入新離心管；(6)加入isolation additive與乙醇混勻；(7)使用過濾柱過濾裂解，離心去除濾液；(8)過濾器內加洗滌液離心，拋棄管中內濾液；(9)洗滌液反復洗滌2次過濾柱，離心去除殘存液體；(10)過濾柱轉移至新收集管，加入洗脫液于過濾柱上，室溫下靜置半小時；(11)過濾器內加入洗滌液；室溫靜置30～60 s，離心；(12)再次洗滌過濾柱2次，離心去除殘液；(13)轉移柱子于另一收集管，加洗脫液靜置，離心得到RNA；(14)通過紫外分光光度計測量吸光度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其RNA完整性。

1.2.4 qRT-PCR檢測miR-146a表達 RNA逆轉錄：①于EP管中加總RNA與oligo，再加DEPC水混勻，離心；②于PCR儀溫浴5 min后再冰浴3 min；③配制RT反應體系，在EP管內加dNTP mix、reaction buffer、ribolock rnase inhibitor、revertAid m-mulv reverse transcriptase；④反應體系溫水水浴1 h后，于70 ℃下水浴5 min使RT酶發生失活；⑤逆轉錄為cDNA，冷凍保存。定量檢測PCR：①去除cDNA為模板，配置PCR反應體系；②高溫下預變性5 min，再變性10 s；③于60 ℃下退火延伸30 ℃，擴增循環，于60 ℃下延伸采集熒光；結束后得到樣本CT值[9]。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 患者miR-146a表達情況

陽性組胃癌組織miR-146a表達水平高于陰性組(P<0.05)。見圖1。

圖1 組織miR-146a表達水平

2.2 幽門螺桿菌感染與胃癌惡性程度關系

幽門螺桿菌感染陽性組與陰性組患者在腫瘤類型方面無統計學意義(P>0.05)；幽門螺桿菌感染與胃癌患者腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表1。

表1 幽門螺桿菌感染與胃癌惡性程度關系/例

2.3 胃癌惡性進展的危險因素

經Cox比例風險回歸模型多因素分析顯示，幽門螺桿菌感染與淋巴結轉移為影響胃癌惡性進展的危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 多因素Cox比例回歸模型分析胃癌惡性進展

3 討論

胃癌具有高侵襲性與轉移率，患者存活率低。隨著如今生活水平提高、飲食結構與生活習慣的改變，胃癌發病率逐年上升且具有年輕化趨勢。多數胃癌患者確診時已為中晚期，傳統手術療效不佳，術后復發和轉移率較高，5年生存率低于50%[10-11]。故確定胃癌發生發展機制，可為早期防治提供參考依據。

胃癌發生發展為長期多因素影響作用結果，與遺傳、飲食習慣、消化疾病、幽門螺桿菌感染等因素有關，其中幽門螺桿菌感染為公認的胃癌重要誘因。研究顯示[12]，胃炎、胃潰瘍等疾病中均能檢測出幽門螺桿菌，持續幽門螺桿菌感染可導致腸上皮化生、胃黏膜萎縮等，進而發展為胃癌。幽門螺桿菌多寄居在胃竇黏膜小凹中，該部位常發生腸上皮化生、不典型增生，是胃癌發病率最高部位。長期幽門螺桿菌慢性感染可使胃黏膜細胞分泌炎癥因子，進而引發粒細胞與淋巴細胞出現浸潤，局部產生慢性炎癥，并使胃黏膜萎縮或不典型增生[13-14]。故幽門螺桿菌感染為胃癌發病的危險因素。幽門螺桿菌感染導致胃癌發生為臨床公認，但其感染與胃癌惡性進展關系尚存在爭議。miRNA 為內源性非編碼調控小分子RNA家族，在真核生物中廣泛存在，多種細胞生物基因組編碼。miRNAs參與多種生理病理過程，其中miRNA在腫瘤中研究最活躍[15]。多項研究表明miRNA參與細胞增殖分化、凋亡等多種腫瘤發生發展的生物學過程，其異常表達與腫瘤發生發展和患者預后有關。miR-146a位于第5號染色體上，對細胞生長分化與存活等生命過程有影響作用，與腫瘤發生發展密切相關[16-17]。rs2910164位于miR-146a前體序列上，堿基G>C突變使莖環區配位錯亂。體外研究顯示，pre-miR-146a序列中C等位基因對應G等位基因，pre-與成熟的miR-146a量均降低，C等位基因干擾核因子結合pre-miR-146a[18-19]。多種癌細胞株證實SNP對成熟miR-146a表達有一定影響，包括胃癌、甲狀腺癌、卵巢癌等。miR-146a變異與胃癌關系的研究集中于發病風險。不同研究的miR-146a基因型與胃癌發病風險關系有一定差異，但多數研究顯示GG基因型會提高胃癌發病風險。正常組織與癌旁組織中的miRNA表達具有顯著差異，差異表達可能為癌基因或抑癌基因在腫瘤發生中作用。miR-146a為miRNA成員，為癌基因或抑癌基因，能發揮不同生物學作用[20]。miR-146a于膠質瘤內表達低于癌旁正常組織，胃癌組織中表達也類似，但在甲狀腺癌中發表達上調。本研究胃癌組織中miR-146a表達下調。腫瘤細胞分化程度不同，其miRNA表達量也不盡相同。miR-146a在高分化細胞中表達最高，低分化癌細胞中表達量最低，說明miR-146a表達與腫瘤分化嚴重程度有關[21-22]。

細胞增殖凋亡為生物體生長發育與繁殖過程中必須的環節，但當細胞增殖發生失控，機體本身正常機制被擾亂而誘發腫瘤。過表達miR-146a對胃癌細胞遷移有抑制作用，下調miR-146a能提高癌細胞遷移力[23-24]。本研究證實miR-146a對胃癌細胞增殖凋亡有一定影響。將miR-146a mimics與miR-146a control轉染至胃癌組織中，顯示轉染miR-146a mimics細胞增殖低于miR-146a control，其凋亡率高于miR-146a control，提示轉染miR-146a模擬物能抑制細胞增殖，對其凋亡具有促進作用[25-26]。細胞凋亡受多基因調控，促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2為重要蛋白，Bax上升能使細胞凋亡，當Bcl-2上升可降低細胞凋亡率。故研究提出細胞凋亡與Bax和Bcl-2比率相關，當該蛋白比率上調可抑制細胞凋亡，反之促進細胞凋亡。幽門螺桿菌感染促進胃癌侵襲與轉移機制不明確，可能與miR-146a高表達有關[27-28]。

綜上所述，幽門螺桿菌感染對胃癌組織miR-146a表達具有上調作用，能促進胃癌侵襲轉移能力，可為臨床早期防治胃癌提供參考依據。