HPV16感染與宮頸鱗癌的相關性及對Wnt/β-catenin信號轉導通路表達的影響

張秀娟 郭東雅 賈玖麗 馬松雅 李 紅 劉姍姍

近年來我國宮頸癌發病呈上升趨勢，每年約50萬新發病例，其中宮頸鱗癌(SCC)是宮頸癌主要類型，可占宮頸癌總數的70%以上[1]。相關研究發現，宮頸癌發生與人乳頭瘤病毒16(HPV16)的持續感染密切相關，而癌癥發生是多種因素綜合作用的結果，因此HPV16感染的普通宮頸細胞轉化為癌細胞需要疊加因素，如多種相關信號通路的激活[2]。基于此，有學者提出了宮頸癌發展的階梯式致癌學說[3]。Wnt/β-catenin是一種在惡性腫瘤中異常激活的經典信號通路，且在各種類型腫瘤發生發展過程中起促癌作用。目前關于HPV16感染對Wnt/β-catenin通路表達的影響機制尚不明確，本次通過分析不同宮頸組織HPV16感染情況及Wnt/β-catenin通路蛋白表達情況，進一步研究HPV16及Wnt信號通路在宮頸癌發生發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2017年6月到2021年6月我院因手術切除獲得的106例SCC組織(其中FIGO分期[4]中Ⅰ期57例，Ⅱ期49例；分化程度：低分化21例，中分化39例，高分化46例；淺層浸潤44例，深層浸潤62例；淋巴結轉移59例，未發生淋巴結轉移47例)、76例宮頸上皮瘤變組織(其中 CINⅠ29例，CINⅡ20例，CINⅢ27例)和54例正常宮頸組織(子宮肌瘤患者行全子宮切除術獲得)，所有患者經病理檢測確診，標本采集前未接受過放化療或其他抗腫瘤藥物治療，且患者不存在其他腫瘤。

1.2 方法

收集SCC患者臨床資料，包括年齡、FIGO分期、分化程度、浸潤深度、是否出現淋巴結轉移等，采用熒光定量PCR及免疫組化法檢測各組HPV16感染及宮頸組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白表達情況，分析不同宮頸組織中HPV16感染率及Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達情況。將SCC患者按照不同臨床病理情況進行分類，分析不同臨床病理患者HPV16感染率及Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達率差異，采用Pearson檢驗分析HPV16感染與臨床病理及Wnt-3a、β-catenin蛋白表達相關性。

1.2.1 HPV感染檢測方法 將石蠟包裹的宮頸組織置于離心管，加入二甲苯震蕩，以12000 r/min(半徑8.7 cm)離心5 min，取沉淀加入無水乙醇震蕩，同上再次離心，再次取沉淀在勻漿器中研磨，提取組織中DNA，以提取的DNA為模板采用PCR儀(美國Eppendrof公司)擴增HPV16的E6基因。當溶液中有模板時，可檢測到探針5'段熒光基團發出的信號，并以此作為感染陽性。循環條件：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 35 s，共30 cycles，72℃ 10 min，1個cycle。引物序列：上游5'-CCACCCAGAAAGTTACCACA-3'，下 游 5'-TGCAACAAGACATACATCGA-3'。

1.2.2 Wnt-3a、β-catenin蛋白表達檢測方法 將病理組織加入二甲苯脫蠟，在蔗糖溶液中過夜，取出加入PBS清洗，隨后加入過氧化氫甲醇處理30 min，再次PBS清洗，吸去多余洗液，滴加Wnt-3a、β-catenin免抗人單克隆抗體，4℃過夜，取出后PBS清洗然后滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，隨后加入蘇木精復染，中性膠封片，并設置PBS代替一抗作為陰性對照。判定方式：在顯微鏡400倍放大下選擇5個視野，每個視野中選擇100個細胞，以細胞中出現黃色、棕黃色為陽性。以陽性細胞占總細胞比例計分：<2%為0分；≥2%～20%為1分；>20%～50%為2分；>50%為3分。染色深度計分：0分無著色；1分淺著色；2分深著色。兩者相乘為最終表達水平計分，以3分及以上為陽性表達。所有片子均由我院2位病理科醫師采用雙盲法判讀。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 各組HPV16感染及宮頸組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白表達情況

Wnt-3a蛋白在各宮頸組織中均表達在胞質；而β-catenin蛋白在正常宮頸組織中表達在細胞膜，在CIN組織和SCC組織中主要表達在胞質和胞核。HPV16感染率、Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達率在各組中比較存在統計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組HPV16感染及宮頸組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達情況(例，%)

2.2 不同臨床特征SCC組織中HPV16感染情況

FIGO分期Ⅱ期、中低分化、淋巴結轉移患者HPV16感染率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化、淋巴結未轉移患者(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床特征SCC組織中HPV16感染情況/例

2.3 不同臨床特征SCC組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達情況

FIGO分期Ⅱ期、中低分化患者Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化患者(P<0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征SCC組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達情況/例

2.4 HPV16感染與宮頸癌臨床病理及Wnt-3a、β-catenin蛋白表達的關系

Pearson相關性分析顯示，HPV16感染與宮頸鱗癌分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移、Wnt-3a、β-catenin表達呈正相關(γ>0，P<0.05)，見表4。Wnt-3a、β-catenin與宮頸鱗癌分化程度、FIGO分期與呈正相關(γ=0.326、0.413，γ=0.288、0.335，P均<0.001)。

表4 HPV16感染與宮頸癌臨床病理及Wnt-3a、β-catenin蛋白表達關系

3 討論

SCC的發生是一個連續漫長的過程，是婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，多項流行病學調查已經證實其與HPV感染的密切關系[5]。HPV種類眾多，目前已知的高達100多種，其中超過30種與宮頸細胞感染有關。HPV16是一種高危型HPV，已有研究發現HPV16的持續感染是宮頸癌發病的重要因素[6]。本次研究檢測了正常宮頸組織、CIN組織及SCC組織中HPV16感染情況，發現隨病變程度增加HPV16感染率也隨之升高，驗證了HPV16感染是SCC發生的重要致病因素。本次研究還發現，FIGO分期Ⅱ期、中低分化、淋巴結轉移患者HPV16感染率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化、淋巴結未轉移患者，提示HPV16感染可能參與了SCC發生發展及侵襲、轉移過程。還有研究發現，SCC發病往往起始于包括HPV16在內的HPV感染，但卻不是充分因素[7]。也有報道顯示，宮頸癌發病率遠低于HPV感染率，提示只有部分HPV感染患者才會發展為宮頸癌[8]。相關研究認為，HPV感染可能是SCC的一種內源性因素，其可引發機體中癌基因異常激活、免疫調節紊亂和抑癌基因失活等一系列變化，造成細胞癌變和癌組織的形成[9]。已有研究發現HPV早期基因區E6和E7基因是主要的致癌基因，可以影響多個腫瘤發生相關生物信號傳導通路，如Wnt/β-catenin[10]。探究SCC發生發展的分子層面機制對患者實施個性化診療和靶向阻斷治療具有重要價值。

Wnt信號通路目前已經發現在各種類型惡性腫瘤中起到促癌作用，被認為是潛在的腫瘤標志物，且能在一定程度上預測預后。有學者通過對比果蠅和小鼠致癌基因發現wg與int-1具有高度同源性，因此將wg和int-1統稱為wnt基因[11]。相關研究顯示，wnt蛋白能激活細胞中wnt信號通路，其中經典通路為Wnt/β-catenin信號通路[12]。Wnt/β-catenin信號通路目前已經在多項研究中被證實參與了宮頸癌的發生發展，在此過程中，其上游信號激活和引發的β-catenin異常聚集是宮頸細胞發生癌變的關鍵過程[13-14]。本次通過免疫組織法檢測發現，從正常宮頸組織、CIN組織到SCC組織，Wnt-3a、β-catenin蛋白在胞質中表達均呈上升趨勢。與正常宮頸組織相比，SCC組織中β-catenin在胞膜上表達明顯減少，提示Wnt-3a、β-catenin蛋白表達與SCC的發生存在一定相關性。有學者采用RT-PCR檢測正常宮頸炎組織和宮頸癌組織中Wnt-3a、β-catenin蛋白表達情況，發現隨著病變程度的增加，兩者表達量逐漸增加[15]，同時也進一步證實了Wnt/β-catenin信號通路在SCC發展中作用。有學者研究發現，Wnt/β-catenin信號通路激活后可引發宮頸癌細胞增殖過程由G1期向S期轉換，增強細胞侵襲、轉移及耐藥能力[16]。本次研究中FIGO分期Ⅱ期、中低分化患者Wnt-3a、β-catenin蛋白陽性表達率分別高于FIGO分期Ⅰ期、高分化患者，證實Wnt-3a、β-catenin蛋白表達與SCC臨床病理進展相關。

HPV目前已經證實與SCC發生發展密切相關[17]，且HPV感染與宮頸鱗癌分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移有關，證實其在SCC發生發展及轉移中起到重要作用。本次研究還發現，HPV16感染率與Wnt-3a、β-catenin表達呈正相關，提示三者可能在SCC病變過程起協同作用。相關研究顯示，HPV16中的E6基因沉默能減少HPV16感染細胞中異位β-catenin表達，提示E6起到激活Wnt通路作用[18]。還有研究顯示，E6蛋白促進Wnt/β-catenin通路激活，引發p53降解增加，導致了β-catenin的堆積和聚集[19-20]。因此Wnt通路激活可能是建立在HPV16感染上，并最終導致了SCC的發生。

綜上所述，SCC中HPV16感染率明顯偏高，且與SCC發生發展及轉移有關。HPV16感染、Wnt-3a、β-catenin蛋白表達可能在SCC發展過程中起到協同作用，可為SCC的臨床治療提供新的思路。