2017—2021年成都市貓細小病毒的檢測及其VP2基因的變異分析

周 群，楊 苑，宋 鑫，何欣怡，曹 慧，張 斌,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室，成都 610041)

貓細小病毒(feline parvovirus, FPV)為細小病毒科、細小病毒屬的成員，是引起貓和其他貓科動物病毒性腹瀉的主要病原體之一[1]。臨床特征表現為高熱、嘔吐、腹瀉、白細胞減少及出血性急性腸炎，具有高發病率和死亡率[2]。

FPV是體型最小的DNA病毒[3-4]。其基因組包含兩種蛋白：非結構蛋白NS1和NS2，結構蛋白VP1和VP2[4-5]。VP2是構成FPV衣殼蛋白的主要成分，約占病毒粒子的90%[5]，決定了FPV在宿主范圍、血凝性和抗原性方面的特點，在病毒感染過程中起關鍵性作用，常作為疫苗研發的靶抗原[3]。VP2蛋白氨基酸關鍵位點的突變常導致細小病毒感染發病機制和細胞嗜性發生改變，產生新的變異毒株，同時也常作為細小病毒分型的依據[6]。1965年首次從患病貓中分離出的FPV，目前已在全球范圍內廣泛流行[7]。犬貓細小病毒密切相關，可在各自的宿主中引起疾病[7-8]。VP2蛋白是決定犬細小病毒(canine parvovirus，CPV)和FPV抗原特性、宿主范圍和受體結合的關鍵蛋白，由于CPV VP2蛋白5～6個關鍵的氨基酸發生變化，使CPV新變體毒株(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)獲得了新的宿主范圍，可同時感染貓和犬[6, 9-10]。

目前，商品化的FPV疫苗已在全球各國廣泛應用，但FPV仍然在世界各國流行，并未得到有效控制[11-14]。國內對FPV的分子流行病學相關的調查研究較少，FPV在四川地區的流行情況和流行毒株的分子特征尚不明確[15-16]。本研究收集了來自成都市的168份貓腹瀉糞便樣本，用PCR方法進行FPV檢測，旨在明確成都地區FPV的流行情況及其分子特征，豐富我國FPV的流行病學資料，為研發新型有效的FPV疫苗提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 2017-2021年從成都地區3家寵物醫院采集發病貓糞便樣本168份，病貓均表現為腹瀉、嘔吐、食欲廢絕和雙相熱等臨床癥狀。采樣并記錄發病貓的性別和年齡等信息(表1)，將獲得的糞便樣本加入病毒保存液中，置于-80 ℃保存備用。

表1 樣本信息及FPV檢出情況

1.1.2 主要試劑與儀器 Quick Taq Hs DyeMix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；STE緩沖液、蛋白激酶K、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa生物技術有限公司；E.coliDH5α購自北京天根生化科技有限公司；PCR核酸擴增儀購自Bio-Red有限公司。

1.1.3 引物 參考相關文獻報道[17]，合成用于FPV檢測的引物FPV-F：GGATGGGTGGAAATCACAGC，FPV-R：ATAACCAACCTCAGCTGGTC。用于FPV VP2基因全基因組擴增的引物VP2-F：TTTGAATTCATGAGTGATGGAGCAGTT，VP2-R：GGGCTCGAGTTAATATAATTTTCTAGG。擴增片段分別長度為845和1 755 bp。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 貓糞便樣本總DNA的提取 采用酚-氯仿法分別提取貓糞便樣本中的總DNA，提取完成后置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 FPV的檢測與VP2全基因組擴增 利用FPV檢測引物[17]對本實驗室保存的FPV陽性樣本DNA進行PCR擴增，PCR產物純化后與pMD19-T載體連接，轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性重組質粒由上海生工生物有限公司雙向測序，將測序成功的陽性質粒10倍倍比稀釋至10-4后保存備用。以168份樣本的DNA為模板，使用Quick Taq Hs DyeMix進行FPV的檢測和VP2全長的擴增，具體操作步驟參照說明書進行，每次PCR均設立陰、陽性對照。PCR產物經克隆和轉化后送生工生物有限公司雙向測序，獲得FPVVP2基因全長序列。

1.2.3 細小病毒VP2基因遺傳進化分析 將本研究獲得的細小病毒VP2基因全長序列與GenBank中的38株國內外經典犬貓細小病毒株和5株犬貓細小病毒疫苗株的VP2基因參考序列進行比對分析。使用DNAstar中的MegAlign進行同源性分析，利用MEGA7.0序列分析軟件，采用鄰近法(Bootstrap自舉值選擇1 000次)構建系統遺傳發育樹。

1.2.4 統計學分析 通過卡方分析，使用非參數方法比較FPV檢出率在品種、年齡和性別方面的差異。通過Epi InfoTM7.2軟件進一步估計差異的比值比(odds ratio, OR)及其95%置信區間(95% confidence interval, 95% CI)。雙因素ANOVA分析通過IBM SPSS Statistics 23.0進行分析。相關P值分別為<0.05或<0.01，則認為數值差異具有統計學顯著性或高度顯著性。

2 結 果

2.1 FPV檢測結果與分析

用PCR方法對168份貓糞便樣本進行FPV檢測。結果顯示成都地區貓群中FPV感染率高，118份樣本檢出FPV陽性，陽性率為70.2%(95% CI=62.7%～77.0%)。如表2所示，FPV在雄性貓和雌性貓中檢出率分別為70.2%(33/47)、65.7%(23/35)。幼齡貓(≤6月齡)和成年貓(>6月齡)檢出率則分別為80.6%(29/36)和56.3%(27/48)。純種貓和混血貓的檢出率分別為68.5%(37/54)和67.7%(21/31)。結果顯示(表2)，成都地區FPV的感染率與貓的年齡(P=0.02)顯著相關，但與貓的性別(P=0.81)和品種(P=1)均不相關。

表2 FPV的流行率與性別、品種和年齡的相關性

2.2 FPV VP2基因同源性分析

為進一步了解成都地區FPVVP2基因的分子特征和遺傳變異，根據不同地區、生活環境和采樣時間選取13份FPV陽性樣本測定其VP2基因，獲得13株FPVVP2基因全長序列(SMU-D3、SMU-D4、SMU-D28、SMU-D18、SMU-D14、SMU-D46、SMU-D50、SMU-D53、SMU-D74、SMU-D87、SMU-F33、SMU-SC20-6和SMU-SC20-2(GenBank No.MZ442302-MZ442314)。本研究中13株毒株之間的核苷酸序列同源性為97.2%～100%，氨基酸序列同源性為97.4%～100%；與GenBank中43株VP2基因參考序列之間的核苷酸同源性為97.1%～100%，氨基酸序列同源性為97.1%～100%。值得注意的是，本研究中SMU-D18和SMU-D14兩株毒株與2株2019年中國報道的CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)同源性為100%，而與FPV毒株同源性為97.4%。氨基酸序列分析顯示(圖1)，SMU-D18毒株和SMU-D14毒株VP2蛋白的第426位氨基酸為Asn，與new CPV-2a毒株一致；此外，本研究中SMU-D46毒株的VP2蛋白氨基酸序列存在Ser293Phe和Ser297Phe兩處獨特的突變，另外10株毒株VP2蛋白與參考毒株相比均無明顯的氨基酸突變。

圖1 13株FPV毒株部分氨基酸序列比對圖

2.3 FPV VP2基因遺傳進化分析

利用MEGA7.0軟件對13株FPVVP2基因序列進行系統發育分析顯示(圖2)，本研究所獲得的毒株11株為貓細小病毒(FPV)，2株為貓源犬細小病毒(CPV)。SMU-D18毒株和SMU-D14毒株與CPV聚為一個大的分支，與FPV親緣關系較遠，與中國CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)親緣關系最近，為貓源犬細小病毒。另外11株FPV與GenBank中已知的細小病毒VP2基因序列在進化樹中聚為3個不同的分支，本研究暫命名為G1、G2和G3。4株本研究中的毒株(SMU-D3、SMU-SC20-2、SMU-SC20-6和SMU-F33)與6株分別來自亞洲和歐洲的毒株聚為G1型分支；G2型分支由來自歐洲、亞洲和美洲的9株毒株組成；7株本研究中的毒株同屬于G3型，SMU-D46毒株單獨形成一個分支，SMU-D4和SMU-D53毒株與我國2019年分離的毒株BJ006(GenBank No.MT270585.1)親緣關系最近，SMU-D28、SMU-D87、SMU-D50和SMU-D74與4株我國分離的毒株在進化樹的底端聚為一支。值得注意的是，貓細小病毒疫苗株Cu-4在系統發育樹中位于G2分支中，與我國流行的FPV毒株親緣關系較遠。

●.本研究中的毒株; ■.犬、貓細小病毒疫苗株

3 討 論

FPV具有高度傳染性，是嚴重危害貓科動物所有成員的重大病原之一[7]。全球各國均有FPV的流行，但各國FPV的感染率差異較大，在28.4%～94.3%之間[11-14]。自首次分離以來，我國常有關于FPV的報道，但近年來FPV在我國西南地區貓群中的流行情況仍不清楚[15-16]。本研究采集了168份貓腹瀉糞便樣本進行FPV檢測，檢出率為70.2%，遠高于我國以往報道的FPV的檢出率(11.4%～38.4%)[16-17]。研究表明，FPV的檢出率與患病貓的臨床癥狀明顯相關，腹瀉貓糞便樣本的檢出率明顯高于臨床健康貓糞便樣本[17]，這可能是本研究FPV檢出率明顯高于其他地區的原因之一。與之前的研究一致，本研究中FPV的檢出率與患病貓的年齡顯著相關，而與患病貓的性別和品種無顯著相關性[17]。

在20世紀70年代后期，犬細小病毒2型(canine parvovirus-2, CPV-2)成為犬中的一種新病原體，原型CPV-2最初不能與貓轉鐵蛋白受體結合，因而不能感染貓[9]。然而，隨后出現并取代CPV-2的遺傳變異體CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c很快獲得了對貓的感染性，這些CPV-2新抗原變體VP2蛋白第300殘基均表現由Ala突變為Gly，引起的疾病與貓泛白細胞減少癥無法區分[6,9-10]。1987年首次檢測到原型CPV-2a的一個新的遺傳變異體，在VP2氨基酸297殘基從Ser到Ala發生非同義替換，被命名為new CPV-2a型并且在全球范圍內流行[6]。而本研究中SMU-D18和SMU-D14毒株與FPV毒株的同源性為97.4%，卻與new CPV-2a毒株同源性為100%，表明兩株毒株為new CPV-2a毒株感染貓，為貓源犬細小毒株。

有趣的是，同樣位于VP2氨基酸297殘基，本研究中的SMU-D46毒株發生了與CPV不同的由Ser到Phe突變，同時在293殘基處也發生了從Ser到Phe的獨特的突變。以往的研究表明，new CPV-2a突變Ser297Ala雖然位于B抗原表位上，但其不會改變變體的抗原性質[6, 8, 18-20]，推測其可能會影響病毒與細胞受體的結合。然而，本研究SMU-D46毒株在293和297氨基酸位點均發生了同樣的突變，這是否會引起FPV抗原類型的改變還有待進一步研究。表明new CPV-2a和FPV在我國貓群中共同流行[7]，巨大的進化壓力導致CPV和FPV新變體不斷出現，提示研究者應加強對CPV和FPV的監測和防控。

系統發育分析顯示，本研究11株FPV毒株均與國內毒株親緣關系較近，與GenBank中FPV參考毒株在進化樹中聚為3個基因群，成都地區流行的FPV毒株分別位于G1和G3群中，兩個基因群遺傳關系相距甚遠，7株毒株在G3群中又分別聚為兩簇，提示成都地區FPV不僅流行率高，并且流行的毒株呈多樣性，這更加不利于FPV的防控。與同源性分析結果一致，SMU-D46毒株在G3群中單獨形成一個分支，與其他毒株表現出獨特的遺傳進化關系。值得注意的是，不論是CPV還是FPV疫苗株均未與我國流行毒株聚為一支，急需重新評估市售商品化疫苗對我國流行毒株的保護率，及早研發針對我國新型流行毒株的有效疫苗。

4 結 論

本研究調查了2017-2021年FPV在四川成都地區的流行情況，豐富了四川成都地區FPV的流行病學資料。FPV在成都地區貓群中流行率遠高于我國其他地區，并且在VP2蛋白關鍵位點存在突變，產生了新的變體，同時存在new CPV-2a毒株的感染。