屎腸球菌對感染柔嫩艾美耳球蟲肉雞生長性能和腸道屏障的影響

焦宇洲，楊歡歡，盧 垚，史聰聰，徐曉娟，蔡旭旺*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；2.武漢科緣生物發(fā)展有限責任公司，武漢 430206)

球蟲病是由艾美耳球蟲感染引起的雞腸道重要寄生蟲病，目前公認有7種艾美耳球蟲可以引起雞球蟲病，其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)寄生于盲腸，是危害最為嚴重的一種[1]。E.tenella感染會降低肉雞生長性能、引起出血性腹瀉、降低機體對其他病原體的抵抗力[2]，發(fā)病率高達70%，死亡率為30%，嚴重時可達80%，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[3]。隨著化學藥物的不斷使用，耐藥性問題愈發(fā)嚴重，人們對綠色健康食品的迫切需求使球蟲病的防控面臨新的挑戰(zhàn)，因此，家禽養(yǎng)殖業(yè)亟需一種安全有效的新型抗球蟲方法。

屎腸球菌是從健康動物和人體發(fā)現(xiàn)的一種產(chǎn)乳酸的革蘭陽性菌，屬于乳酸菌，是一種對動物健康有益的益生菌，于1989年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準為可直接進行飼喂的益生菌，我國于1999年確定屎腸球菌可以添加于動物飼料中[4]。作為益生菌，屎腸球菌可以促進肉雞生長性能、改善腸道形態(tài)、調(diào)節(jié)腸道微生物組成[5]。近年來的研究顯示，屎腸球菌可以通過調(diào)節(jié)免疫反應、維持腸道完整性來促進感染大腸桿菌肉雞的生長并降低死亡率[6]，還有研究表明，屎腸球菌、動物雙歧桿菌和唾液乳桿菌的混合添加可以產(chǎn)生與拉沙里菌素相似的抗混合球蟲的效果[7]。但是目前缺乏關于屎腸球菌單獨添加在球蟲病感染中的研究，因此，本研究在飼糧中添加不同水平的屎腸球菌，通過分析雞的日增重、球蟲卵囊排出量、腸道損傷和病理變化、盲腸腸道iNOS和屏障蛋白相關基因的表達量來探究屎腸球菌對感染E.tenella肉雞的有益作用，以期為雞球蟲病的防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和菌種制備

1日齡羅斯308白羽肉雞，購自河南省豐園禽業(yè)有限公司。飼養(yǎng)于甲醛熏蒸消毒的無球蟲房間(籠養(yǎng))，雞籠經(jīng)火焰灼燒滅菌。試驗用屎腸球菌(EF1)由武漢科緣生物發(fā)展有限責任公司保存；鹽霉素購自大連榮海生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

采用單因素試驗設計，選取體重相近、健康狀況良好的1日齡白羽肉雞180羽，隨機分為5組，包括空白對照組(NC組)、陽性對照組(PC組)、抗生素組(SAL組)和兩個試驗組(EA、EB組)，每組3個重復，每個重復12羽。空白對照和陽性對照組均飼喂基礎飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1；抗生素組飼喂在基礎飼糧中添加70 mg·kg-1鹽霉素的試驗飼糧；兩個試驗組(EA、EB組)分別飼喂在飼糧中添加1.0×108、2.5×109CFU·kg-1屎腸球菌的試驗飼糧。飼喂14 d后，除空白對照組，其余各組雞經(jīng)口人工感染E.tenella孢子化卵囊(經(jīng)口灌入200 μL，含1.0×105個孢子化卵囊)。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗使用4層的層疊式雞籠進行籠養(yǎng)，每籠(70 cm×70 cm×35 cm)12羽，試驗重復均勻分布，雞舍溫度第1周為33～35 ℃，之后每周下降2 ℃。肉雞自由采食和飲水。

1.4 樣品采集

22日齡時每組隨機取5羽，斷頸處死后剖開腹腔，剪取約2 cm的盲腸腸段，用預冷至4 ℃的滅菌PBS將腸內(nèi)容物沖洗干凈，液氮速凍后保存于-80 ℃用于RNA的提取，另取2 cm固定于10%福爾馬林中，用于盲腸組織病理學檢測。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 生長性能 1日齡時稱雛雞體重，將體重相近的雛雞隨機分組，分組后NC和PC組飼喂基礎飼糧，SAL、EA和EB組分別飼喂含鹽霉素和屎腸球菌的飼糧，分別于第14(感染前)、22(感染第8天)天稱重記錄，計算平均日增重(ADG)。

1.5.2 球蟲卵囊排出數(shù) 麥克馬斯特法[8](McMaster’s method)：計數(shù)時，每份糞便充分混勻后，稱取5 g用燒杯盛裝糞便樣本，先加入30 mL飽和食鹽水，充分攪勻；過80目鋼篩去除糞便雜質(zhì)，剩余沉淀再加入10 mL飽和食鹽水重復過篩；將糞液混勻后立即吸取加入到計數(shù)板的計數(shù)室內(nèi)，靜置5 min；在100倍(10×目鏡，10×物鏡)視野下鏡檢，計數(shù)兩個計數(shù)室的卵囊數(shù)，然后取平均值。計數(shù)室可容納0.15 mL溶液。計算公式：克糞便卵囊數(shù)(OPG)=(A×稀釋倍數(shù)×溶液體積)/(0.15×糞便重量)，A=1個計數(shù)池中的所有球蟲卵囊數(shù)。卵囊值根據(jù)OPG進行評價，OPG(×106)在0～0.10、0.11～1.00、1.10～1.90、2.00～5.90、6.0～10.90之間和>11.00時，分別記為0、5、10、20、30、40分。在感染后第5天開始采集糞便，收集感染后第5、6、7天的糞便分別進行卵囊計數(shù)，最終以其總數(shù)計算OPG。

1.5.3 盲腸病變評分 感染第8天對各組所有存活雞進行安樂死，對盲腸進行病變記分，并將其換算成病變值。盲腸病變記分標準[9]：0分，盲腸壁厚度正常，無肉眼可見病變；1分，盲腸黏膜有點狀出血，盲腸壁不增厚；2分，盲腸內(nèi)容物為黏液，有少許血絲，盲腸壁略增厚，黏膜散在出血點；3分，盲腸內(nèi)有大量血液或有腸芯(血凝塊或灰白色干酪樣的香蕉型塊狀物)，盲腸壁肥厚明顯，盲腸變形；4分，盲腸壁極度增厚，形成干酪樣腸芯，黏膜布滿出血點、出血斑。死亡雞病變也記為4分。記錄各組評分(Grade)，然后計算病變值(Lesion score)。Lesion score=各試驗組內(nèi)的平均病變記分(Grade)×10。

1.5.4 組織病理學檢測 10%福爾馬林中固定的盲腸組織用于蘇木精和伊紅染色(hematoxylin-eosin staining, HE)、阿利新藍(alcian blue, AB)和過碘酸雪夫染色(periodic acid schiff, PAS)染色。組織塊脫水75%、85%、95%、95%、100%、100%的乙醇各1 h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各20 min，之后再進入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ各1 h，將包埋好的蠟塊進行切片。HE染色如下：切片依次放入二甲苯Ⅰ 10 min、Ⅱ 10 min、100%、95%、75%的乙醇中各5 min，自來水沖洗5 min，蘇木精染色5 min、流水沖洗5 min，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒、自來水沖洗、0.6%氨水返藍、流水沖洗、伊紅染色5 min、再75%、95%、100%的乙醇各5 min脫水后置二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 min，滴上中性樹膠封片。使用正置顯微鏡(奧林巴斯BX53，目鏡10×，物鏡40×)進行觀察，通過HE染色觀察盲腸結構，AB-PAS染色觀察腸道酸性蛋白和杯狀細胞。

1.5.5 腸道細胞因子和蛋白的表達 用TRIzol法提取總RNA，取100 mg盲腸組織于1.5 mL離心管中，并加入大小鋼珠各1個，再加入1 mL TRIzol，用組織破碎儀進行勻漿，靜置5 min后加入200 μL氯仿，震蕩混勻后靜置3 min，12 000×g4 ℃離心15 min，取500 μL上清液于新的離心管中，加入等體積的異丙醇，渦旋后靜置10 min，12 000×g4 ℃離心10 min，沉淀RNA，棄上清，加入1 mL 75%的乙醇渦旋，7 500×g4 ℃離心5 min，棄上清，置超凈臺風干，加適量DEPC水溶解沉淀，用Nanodrop one測定RNA濃度，將提取的RNA進行反轉錄，得到的cDNA保存于-20 ℃。將cDNA用于腸道iNOS，黏蛋白MUC2，緊密連接蛋白Occludin、JAM2和ZO-1基因表達量的檢測，參照文獻設計所需引物(表2)，并由擎科生物科技有限公司合成。用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達量。

表2 qRT-PCR引物

1.5.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22軟件進行分析(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)。對平均體重、增重、病變評分和腸道iNOS和MUC2、Occludin、JAM2、ZO-1的表達量進行單因素方差分析，Dunnett’s事后多重比較來分析組間的差異性水平，結果用“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結 果

2.1 屎腸球菌對E. tenella感染肉雞生長性能的影響

由表3可知，在E.tenella感染前(1～15日齡)，與PC組相比，SAL組肉雞平均日增重沒有明顯變化(P>0.05)，EA和EB組雛雞平均日增重顯著增加(P<0.05)。在15～22日齡(E.tenella感染期間)，PC組肉雞增重顯著低于NC組(P<0.05)，但是相比于PC組，SAL、EB組均能顯著改善E.tenella感染引起的增重減少(P<0.05)，并且屎腸球菌添加組與抗生素添加組ADG無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。除此之外，分析整個試驗期間(1～22日齡)肉雞平均日增重發(fā)現(xiàn)，EB組平均日增顯著高于其他感染組(P<0.05)，日增重達到NC組日增重的水平。

表3 屎腸球菌對肉雞生長性能的影響

2.2 屎腸球菌對E. tenella感染肉雞OPG、盲腸病變評分和死亡率的影響

E.tenella感染后第3天可以觀察到感染組肉雞精神沉郁，并于感染后第4天發(fā)現(xiàn)有血便排出，第5天血便更加嚴重。E.tenella感染引起盲腸損傷，甚至死亡(表4)。對盲腸進行剖檢發(fā)現(xiàn)，添加鹽霉素和屎腸球菌雖然能夠降低腸道損傷分數(shù)，但是并沒有明顯改善E.tenella感染引起的盲腸損傷(P>0.05)；收集肉雞糞便，進行卵囊計數(shù)發(fā)現(xiàn)，添加鹽霉素和屎腸球菌均可以明顯減少糞便中卵囊數(shù)(P<0.05)，其中EB組OPG最小。除此之外，E.tenella感染導致PC組肉雞平均死亡5羽，相比于PC組，EA組也是平均死亡5羽,SAL組平均死亡僅2羽,EB組僅平均死亡3羽。

表4 屎腸球菌對E. tenella感染肉雞的OPG、盲腸病變評分和死亡數(shù)的影響

2.3 屎腸球菌對E. tenella感染肉雞盲腸病理損傷的影響

通過HE染色對盲腸組織病理學切片觀察發(fā)現(xiàn)，PC組腸絨毛斷裂、無法觀察到正常的腺體結構、存在明顯的炎性浸潤，并且發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲寄生(圖1 C和D)。相比于PC組，SAL和EA、EB組腸絨毛結構相對完整，并且僅發(fā)現(xiàn)少量炎性細胞和球蟲卵囊。AB-PAS染色在PC組僅可以看到大量卵囊寄生，但NC和SAL、EA、EB組可以觀察到腸道分泌較多的酸性蛋白，并且有較多的杯狀細胞。

2.4 屎腸球菌對E. tenella感染肉雞腸道iNOS表達的影響

誘導型一氧化氮合酶(iNOS)在腸道的表達水平高，則表明腸道中NO水平較高。如圖2所示，E.tenella感染使腸道iNOS表達水平顯著下降(P<0.05)；但是相比于PC組，SAL、EA和EB組可以顯著提高腸道iNOS的表達量(P<0.05)，并且屎腸球菌添加呈現(xiàn)出劑量依賴性。

2.5 屎腸球菌對E. tenella感染肉雞腸道屏障蛋白表達的影響

由圖3可知，E.tenella感染可以導致腸道黏蛋白MUC2、緊密連接蛋白Occludin、JAM2和ZO-1的表達量顯著降低(P<0.05)。相比于PC組，SAL組顯著增加MUC2、JAM2和ZO-1的表達量(P<0.05)，同樣地，屎腸球菌添加組EA和EB也顯著增加黏蛋白MUC2和JAM2的表達量(P<0.05),但ZO-1與陽性對照組并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；如圖3B所示，僅有EB組能顯著增加腸道Occludin的表達(P<0.05)。

圖3 盲腸中屏障蛋白基因表達水平

3 討 論

養(yǎng)雞業(yè)是世界上最重要的食物供應產(chǎn)業(yè)之一，據(jù)估計，世界上每年大約生產(chǎn)雞肉900億kg，占人類攝入動物蛋白質(zhì)和脂肪來源的1/3以上[10-11]。雞球蟲病是嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一，由幾種不同種類的艾美耳球蟲寄生于腸道上皮細胞引起，E.tenella主要在盲腸上皮細胞定殖引起腸道損傷，導致排血便、生長性能降低、腸道微生物失調(diào)、免疫功能遭到破壞等，且極易引起繼發(fā)感染。益生菌指通過攝取適當?shù)牧繉κ秤谜叩纳眢w健康能發(fā)揮有益作用的活菌，在宿主體內(nèi)通過調(diào)控腸道微生態(tài)平衡、改善腸道形態(tài)結構、促進飼料攝入和消化、增強宿主免疫功能等方式促進宿主的健康[12]，因此推測，益生菌可能具有一定的抗球蟲效果。生產(chǎn)性能被普遍認為是評價肉雞特定經(jīng)濟價值的方法，已有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂含有羅伊乳酸桿菌、屎腸球菌、動物雙歧桿菌、乳酸球菌和唾液乳酸桿菌等益生菌添加的飼料會提高肉雞的生長性能[13]；張利環(huán)等[14]證明，將干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌以2∶1∶1的比例混合對肉雞進行飼喂，可以顯著提高肉雞平均日增重。當肉雞受到E.tenella感染后增重會顯著降低，飼喂屎腸球菌有利于腸道健康、促進腸道消化吸收、改善肉雞生長性能，減少E.tenella感染引起的損失。在本研究中，屎腸球菌能夠改善肉雞早期生長性能，顯著提高雛雞1～15 d的平均日增重，并且在整個試驗期間2.5×109CFU·kg-1添加組可以預防E.tenella感染引起的增重減少，顯著提高肉雞的增重；曹廣添等[15]也發(fā)現(xiàn)，相比于陰性和陽性對照組，肉雞飼喂屎腸球菌可以顯著提高大腸桿菌感染肉雞的生長性能，這些均表明屎腸球菌對肉雞具有較好的促生長作用。根據(jù)上述結果認為，屎腸球菌可以通過改善肉雞生長性能減少E.tenella感染引起的損失，可分為兩個階段：一是在感染前促進雛雞生長發(fā)育，促進免疫系統(tǒng)的成熟，從而預防E.tenella感染；其次，還可能在肉雞感染后通過促進腸道對營養(yǎng)的消化吸收進而減少E.tenella感染導致的損失。

本研究對感染E.tenella后OPG、死亡率和盲腸損傷進行分析發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌可以顯著減少感染后糞便中的卵囊排出數(shù)、降低死亡率，雖然盲腸病變評分沒有明顯降低，但是通過對組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌添加可以在一定程度上抑制E.tenella感染對腸道絨毛和腺體的破壞，維持了腸道結構的完整性。已有研究也表明，屎腸球菌可以顯著減少糞便中卵囊數(shù)，減少感染肉雞的死亡率(3.33%～10.00%)[16]，Giannenas等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌可以顯著減少糞便中卵囊數(shù)(P<0.05)，并且具有劑量依賴性，結論與本試驗結果相同：屎腸球菌添加組的盲腸損傷評分與感染組沒有顯著性差異，但是可以顯著減少糞便中卵囊數(shù)。iNOS可以誘導精氨酸氧化為NO，協(xié)助巨噬細胞產(chǎn)生免疫應答。飼料添加枯草芽孢桿菌可誘導NO產(chǎn)生，調(diào)控巨噬細胞的免疫功能[18]，添加鼠李糖乳桿菌可使巨噬細胞產(chǎn)生的NO增加，增強宿主免疫功能[19]，充分顯示益生菌可以通過增加NO的產(chǎn)生來增強機體先天性免疫。本試驗則通過檢測腸道iNOS的表達水平間接反映出屎腸球菌可以促進腸道NO的產(chǎn)生，結果顯示，E.tenella感染使PC組腸道iNOS表達水平顯著低于NC組(P<0.05)；EA和EB組同SAL組可以顯著提高腸道iNOS的表達(P<0.05)，表明在屎腸球菌可以誘導iNOS的高表達來促進腸道NO的產(chǎn)生，從而促進宿主免疫反應。推測屎腸球菌可能通過其某種代謝產(chǎn)物直接抑制卵囊的增殖或者是刺激機體免疫反應來阻止卵囊增殖、甚至消滅入侵的卵囊。

腸道屏障和緊密連接是防止病原侵害、維持上皮完整性的主要防御機制。MUC2是主要的分泌性黏蛋白，在維持腸道表面黏液層結構和防止病原入侵內(nèi)部黏液層中起重要作用[20]。炎癥會減少腸道分泌MUC2蛋白的杯狀細胞數(shù)量，導致黏液層得不到補充，增加了進一步感染、細菌移位和炎癥的機會。艾美耳球蟲感染可以顯著降低空腸杯狀細胞的數(shù)量，下調(diào)MUC2基因的表達[21]，但是乳酸菌可以增加杯狀細胞數(shù)量，枯草芽孢桿菌可以提高MUC2的表達水平[22]，本研究也得出相同的結論。腸上皮細胞在保護腸道免受病原侵害中扮演重要角色，緊密連接可以調(diào)節(jié)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)、抵御腸道病原體入侵，并且是腸道上皮細胞健康的重要指標。Occludin和JAM蛋白是重要的跨膜蛋白，是緊密連接的主要結構，ZO-1蛋白是連接三者和上皮細胞肌動蛋白的樞紐[23]。混合艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導致空腸中緊密連接蛋白Occludin、JAM2、ZO-1的表達明顯下調(diào)[24]，而枯草芽孢桿菌添加可以顯著增加腸道JAM2和ZO-1的表達[25]；壞死性腸炎病例的腸道MUC2、Occludin的表達明顯減少，但添加解淀粉芽孢桿菌可以顯著增加其表達量[26]，地衣芽孢桿菌也可以顯著增加球蟲感染后JAM2和Occludin在盲腸的表達[27]等。這些研究結果均表明，益生菌可以通過調(diào)節(jié)腸道黏蛋白和緊密連接蛋白的表達進而增強宿主腸道屏障功能，減少病原引起的腸道損傷。與已有研究相似，本研究也發(fā)現(xiàn)屎腸球菌可以顯著提高Occludin和JAM2的表達量。結合本研究證實，屎腸球菌可以通過調(diào)節(jié)腸道屏障蛋白的表達來維持腸道屏障的正常功能，在一定程度上抵御球蟲入侵，對腸道組織造成損傷。

4 結 論

綜上所述，飼糧中添加E.faecium能夠改善肉雞的生長性能，維持E.tenella感染后盲腸的完整性，通過調(diào)節(jié)腸道iNOS、黏蛋白MUC2、緊密連接蛋白Occludin、JAM2和ZO-1的基因表達水平增強肉雞腸道屏障功能，減少E.tenella感染引起的死亡和卵囊排出，對雞球蟲病具有一定的防治作用，可以減少球蟲病帶來的經(jīng)濟損失，在肉雞生產(chǎn)中具有較大應用前景。