賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉劑對山羊大腦和海馬NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及神經(jīng)遞質(zhì)的影響

張志恒，白 薈，彭立穎，張思學(xué)，賈 冰，魏成威，高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

麻醉劑自1842年就已經(jīng)開始使用，乙醚最先被用于馬和犬的麻醉，之后其他揮發(fā)性麻醉劑如氯仿、乙醚和笑氣等被逐漸應(yīng)用于動物麻醉[1]。多年來，人們普遍認(rèn)為麻醉藥沒有特定的分子靶標(biāo)，它們與神經(jīng)元膜脂相互作用是非特異性的[2-3]。但是，目前的研究認(rèn)為，麻醉藥主要通過與受體蛋白相互作用發(fā)揮效應(yīng)。全身麻醉能改變神經(jīng)元活動，改變神經(jīng)遞質(zhì)的基礎(chǔ)細(xì)胞外活動：受體親和力，以及遞質(zhì)誘導(dǎo)的突觸后反應(yīng)[4]。理解麻醉劑發(fā)揮麻醉作用的機(jī)制有助于指導(dǎo)臨床正確用藥，合理配伍能有效減少麻醉副作用的發(fā)生，在臨床應(yīng)用中有非常重要的意義。

根據(jù)本課題組先前的研究成果，賽拉嗪作為一種α-2腎上腺素能受體激動劑，對山羊具有較好的麻醉效果，主要通過影響山羊不同腦區(qū)ATP酶的活性、NE、DA、Asp、Glu等神經(jīng)遞質(zhì)的含量發(fā)揮中樞麻醉效應(yīng)[5-7]。但是，有研究報道，α2腎上腺素能受體激動劑單獨(dú)使用，可引起山羊、綿羊等發(fā)生呼吸抑制、高碳酸血癥和低氧血癥等麻醉副反應(yīng)[8-9]。咪達(dá)唑侖是苯二氮卓類麻醉劑，具有催眠、抗焦慮、肌肉松弛和抗驚厥作用，咪達(dá)唑侖單獨(dú)作用于山羊，能引起山羊大腦、海馬等組織中cAMP信號通路、GABA、Asp、Glu、Gly等神經(jīng)遞質(zhì)的改變[10-11]。目前，賽拉嗪復(fù)合咪達(dá)唑侖對山羊的麻醉效果及麻醉機(jī)制仍然沒有相關(guān)研究。本試驗旨在明確賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合制劑對山羊的麻醉效果及發(fā)揮麻醉作用的機(jī)理，為臨床小反芻動物麻醉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物

8月齡(體重范圍13～15 kg)健康山羊25只，雌性12只，雄性13只，購自哈爾濱某養(yǎng)殖場。試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照翻正反射變化將動物隨機(jī)分為5組，分別為對照組(肌肉注射生理鹽水)、誘導(dǎo)組(翻正反射還未消失)、麻醉組(翻正反射消失)、恢復(fù)Ⅰ組(輕微刺激后翻正反射恢復(fù))和恢復(fù)Ⅱ組(動物蘇醒且恢復(fù)運(yùn)動)，每組5只。

1.2 試劑

去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，NOS、NO、考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，山羊cGMP測定試劑盒購自R&D systems公司，咪達(dá)唑侖及賽拉嗪由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床外科教研室提供。

1.3 行為學(xué)觀察及樣本采集

山羊經(jīng)肌肉注射賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉劑(1.31 mL·kg-1)，對照組注射生理鹽水，觀察麻醉后動物的行為學(xué)變化，包括誘導(dǎo)時間(注射麻醉藥后到山羊不能站立、倒地不再掙扎的時間)、麻醉維持時間及蘇醒時間；評估復(fù)合制劑的麻醉效果(鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、肌松)并監(jiān)測主要的生理參數(shù)(心率、血氧飽和度和呼吸頻率)，麻醉評分標(biāo)準(zhǔn)參照表1。根據(jù)行為學(xué)變化分別于誘導(dǎo)期、麻醉期、恢復(fù)Ⅰ期和恢復(fù)Ⅱ期，山羊經(jīng)擊昏器擊昏后斷頭處死，收集大腦前額葉皮質(zhì)及海馬組織，使用預(yù)冷(4 ℃)生理鹽水沖洗血跡，之后放入凍存管中液氮冷凍。

表1 鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及肌松評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 神經(jīng)遞質(zhì)的測定

1.4.1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定 采用高效液相色譜(HPLC-熒光)法檢測NE、DA、5-HT及5-HIAA的含量。HPLC條件：Symmetry?C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)為固定相；去離子水和甲醇(80∶20)為流動相；流速設(shè)置為0.6 mL·min-1，進(jìn)樣體積為20 μL；使用Warers2475熒光檢測器，波長設(shè)置為λEX=280 nm，λEM=330 nm。

1.4.2 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的測定 采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法檢測Asp、Glu、Gly及GABA的含量。HPLC條件：流動相液體A和B分別為醋酸鈉緩沖液(0.05 mol·L-1，pH=6.6)，和乙腈/水(50∶50)，流速及進(jìn)樣體積同上，波長為360 nm。

1.5 NO及cGMP含量的測定

1.5.1 比色法測定NO含量及NOS活性 按照南京建成生物工程研究所總一氧化氮合成酶(NOS)測試盒提供的說明書操作，測定總NOS；使用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，之后按照說明書加入各試劑后，比色法測定各管的吸光度值并計算NO含量。

1.5.2 ELISA法測定cGMP含量 按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測定波長450 nm時的OD值并計算cGMP濃度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

2 結(jié) 果

2.1 賽拉嗪-咪達(dá)唑侖合劑對山羊麻醉效果的影響

對照組山羊肌肉注射生理鹽水后行為無明顯變化，賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉劑注射后，山羊逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍及自主活動減少等現(xiàn)象，平穩(wěn)進(jìn)入麻醉狀態(tài)。生物反射監(jiān)測結(jié)果：光反射未消失，眼瞼反射消失、角膜反射減弱。麻醉誘導(dǎo)時間(5.63±2.35)min，麻醉維持時間(56.72±5.38)min。如表2所示，賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉劑在麻醉10～30 min出現(xiàn)心率、血氧飽和度及呼吸頻率降低，但是總體影響較小；并且復(fù)合制劑具有較好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及肌松作用(表3)。

表2 復(fù)合麻醉劑對山羊心率、血氧飽和度及呼吸頻率的影響

表3 復(fù)合麻醉劑對山羊鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及肌松效果的影響

2.2 賽拉嗪-咪達(dá)唑侖合劑對大腦及海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

試驗結(jié)果顯示(圖1)，肌肉注射賽拉嗪-咪達(dá)唑侖合劑后，兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE和DA在大腦和海馬組織中呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，與對照組相比，麻醉期表達(dá)量顯著減少(P<0.01)，而在恢復(fù)Ⅱ期(即蘇醒后)，含量恢復(fù)至正常水平。5-羥色胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和5-HIAA呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，麻醉期表達(dá)量最高，恢復(fù)Ⅱ期下降至正常水平。此外，NE和5-HIAA在大腦中的表達(dá)量較海馬中更低，而DA和5-HT則相反。

A.去甲腎上腺素；B.多巴胺；C.5-羥色胺；D.5-羥吲哚乙酸。與對照組相比，*.P<0.05，**.P<0.01；與麻醉組相比，#.P<0.05，##.P<0.01；下同

2.3 賽拉嗪-咪達(dá)唑侖合劑對大腦及海馬組織氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

Asp和Glu是兩種興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，結(jié)果顯示(圖2)，賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉劑對大腦中Asp和Glu的含量無明顯影響(P>0.05)，而海馬中Asp和Glu呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，與對照組相比，麻醉期海馬組織中Asp和Glu的含量顯著減少(P<0.01)，與麻醉期相比，恢復(fù)Ⅱ期這兩種神經(jīng)遞質(zhì)含量顯著升高并恢復(fù)至正常水平。Gly和GABA是兩種抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，復(fù)合制劑對大腦中Gly的影響呈現(xiàn)先抑制后增加的趨勢，而對GABA則表現(xiàn)為先升高后抑制。此外，與對照組相比，復(fù)合制劑極顯著增加麻醉期海馬中Gly的含量(P<0.01)，但不影響海馬中GABA的表達(dá)。

A.天門冬氨酸；B.谷氨酸；C.甘氨酸；D.γ-氨基丁酸

2.4 賽拉嗪-咪達(dá)唑侖合劑對大腦及海馬組織NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響

NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與很多全麻藥物的中樞麻醉機(jī)制，結(jié)果(圖3)顯示，賽拉嗪-咪達(dá)唑侖合劑在麻醉期，對大腦及海馬中的NO/cGMP信號具有明顯的抑制作用，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。而在麻醉恢復(fù)期，cGMP、NOS及NO表達(dá)均上升至正常水平。

A.環(huán)磷酸鳥苷；B.一氧化氮合酶；C.一氧化氮

3 討 論

復(fù)合麻醉包括化學(xué)藥物復(fù)合麻醉和物理方式與化學(xué)藥物復(fù)合麻醉。先前研究發(fā)現(xiàn)，電針復(fù)合靜松靈[12]或電針復(fù)合隆朋[13]對山羊進(jìn)行麻醉，對生理指標(biāo)影響較小，麻醉藥物用量顯著減少。在獸醫(yī)臨床中，由于經(jīng)濟(jì)成本及技術(shù)操作的限制，小反芻動物通常使用化學(xué)藥物復(fù)合麻醉。賽拉嗪是目前國內(nèi)外應(yīng)用最多的小反芻動物麻醉藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及肌松作用[14-15]，但是有報道稱，α2腎上腺素能受體激動劑單獨(dú)使用可引起呼吸抑制，高碳酸血癥和顯著低氧血癥[9, 16]。Mogoa等[17]發(fā)現(xiàn)賽拉嗪單獨(dú)作用于山羊能發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及肌松作用，但是會引起山羊通氣率降低以及發(fā)生大量流涎；山羊?qū)惱好舾校?zhèn)痛作用主要與賽拉嗪對自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用有關(guān)。本試驗將賽拉嗪與咪達(dá)唑侖聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)復(fù)合制劑對山羊能提供(56.72±5.38)min的麻醉維持時間，具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及肌松作用，并且對心率、血氧飽和度以及呼吸頻率影響較小，提示復(fù)合麻醉能夠減輕賽拉嗪單獨(dú)應(yīng)用的副反應(yīng)。

全身麻醉的作用機(jī)制至今還沒有形成統(tǒng)一的觀點，全麻藥物對大腦中的神經(jīng)遞質(zhì)活動有巨大的影響[18-19]，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)可能是全身麻醉作用的重要靶點[20, 21]。本研究使用賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合制劑麻醉山羊，麻醉期山羊大腦及海馬中DA和NE的水平被明顯抑制，這種作用可能主要是賽拉嗪導(dǎo)致的，因為有研究者使用鹽酸賽拉嗪麻醉大鼠，發(fā)現(xiàn)其大腦中DA和NE的含量顯著降低[22]。此外，使用噻環(huán)乙胺和小型豬復(fù)合麻醉劑(XFM)麻醉大鼠，能顯著增加5-HT的含量[23]。本研究使用賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合制劑能使山羊大腦及海馬中5-HT的含量增加，可能是由于α2受體激動劑與大腦中的5-HT受體相互作用，從而增加了5-HT的含量。

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)損傷、認(rèn)知障礙等過程密切相關(guān)[24]，海馬和前額葉皮層在空間工作記憶和決策中起著至關(guān)重要的作用[25]。異氟醚能抑制突觸前膜谷氨酸的釋放并增加谷氨酸的攝取，使突觸間隙谷氨酸水平減少[26]，這可能是由于全麻藥導(dǎo)致Glu與NMDA受體的結(jié)合被抑制，改變了神經(jīng)元的興奮性[27]。此外，氯胺酮復(fù)合苯巴比妥也被證明能夠減少Glu含量，增加GABA含量[28]。本研究的結(jié)果與以上研究相一致，復(fù)合麻醉劑能降低海馬中Glu含量，增加大腦中GABA含量。復(fù)合麻醉劑對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的作用可能主要是由于苯二氮卓類藥物能與GABAA受體相應(yīng)位點結(jié)合，使受體發(fā)生變構(gòu)，促進(jìn)GABA與低親和力的GABA位點結(jié)合來增加C1-內(nèi)流[29]。

NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能與α2腎上腺素能受體有關(guān)[30]。大腦皮質(zhì)、海馬和尾狀核等部位α2腎上腺素能受體含量較豐富，可樂定和右美托咪啶在一定的劑量范圍內(nèi)，能夠引起這些中樞部位cGMP含量降低，且這種效應(yīng)被育享賓逆轉(zhuǎn)[30]。此外，NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被認(rèn)為與GABA受體相關(guān)[31]。GABAA受體與NOS在中樞具有相同的定位，在同一區(qū)域共同存在，并且GABAA受體活性能被NO和cGMP抑制，GABAA受體活化也能抑制NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)[32]。紅藻氨酸能誘導(dǎo)小腦cGMP含量增加，而咪達(dá)唑侖能抑制這一效應(yīng)，其潛在機(jī)制是通過激活GABAA受體，從而降低NOS活性、NO和cGMP的生成，使cGMP介導(dǎo)的通路被抑制[33]。作者的研究結(jié)果表明，賽拉嗪-咪達(dá)唑侖合劑可能通過激活GABA，抑制NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，從而影響大腦及海馬中的神經(jīng)遞質(zhì)含量。

4 結(jié) 論

賽拉嗪-咪達(dá)唑侖復(fù)合麻醉劑對山羊生理指標(biāo)影響較小，具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及肌松作用。該復(fù)合制劑抑制大腦中NE、DA及Gly含量，增加5-HT、5-HIAA和GABA的含量；減少海馬中DA、NE、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Asp及Glu含量，增加海馬中5-HT、5-HIAA及Gly的含量，并通過抑制兩種組織中的NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與復(fù)合麻醉劑的中樞麻醉機(jī)理。