1株雞傳染性喉氣管炎病毒的基因組特征與致病性

高 昕，羅園園，楊慧明，2，張國中，2，趙 燁*

(1.中國農業大學動物醫學院，北京 100193；2.中國農業大學畜禽疫病診斷研究中心，北京 100193)

傳染性喉氣管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)屬于皰疹病毒科，傳染性喉氣管炎病毒屬，可引起雞的急性、接觸性上呼吸道癥狀。不同ILTV毒株毒力強弱有所差別。急性感染時，發病率和死亡率分別可高達100%和40%，溫和型ILT發病率接近5%～10%，死亡率低于2%。病雞主要表現為呼吸困難、咳嗽、結膜炎及咳出血樣滲出物，剖檢時可見喉部、氣管黏膜腫脹、出血、糜爛和壞死[1]。ILTV于20世紀50年代末期首次在我國報道發生，90年代后,在我國一些地區呈地方性流行，極大地損害了我國養雞業的健康發展[2-5]。

ILTV為線性雙股DNA病毒，其基因組長度為155 kb，分為長獨特區(UL)和短獨特區(US)，US左側為反向重復序列(IRS)，US右側為末端重復序列(TRS)，IRS與TRS區序列相同但方向相反[6]。UL23(TK)、UL27(gB)和UL32基因位于UL區，TK基因是ILTV的主要毒力基因，也是構建基因缺失疫苗的主要靶標[7-8]。UL27(gB)和UL32編碼病毒粒子表面糖蛋白，其中，gB是病毒感染所必需的主要糖蛋白和保護性抗原，可誘導體液免疫[9]。二者保守性高，作者前期研究表明，表達gB和UL32基因的重組雞痘病毒疫苗具有良好安全性和穩定性[10]。ICP4基因位于IRS區域，參與激活病毒早/晚期基因的表達[11]，ICP4基因與病毒毒力存在關聯。

由于ILTV具有急性暴發和長期潛伏感染的特性，需要對ILTV進行實時監控，了解當前流行毒株的基因特征及致病性對于控制ILT的流行具有重要意義。本試驗對1株ILTV分離株的關鍵毒力基因序列TK、ICP4及免疫糖蛋白序列gB、UL32進行分析，了解其分子進化特征及在進化樹中與流行毒株的親緣關系，并開展SPF雞的致病性研究，研究結果豐富了我國ILTV分子流行病學調查內容，為進一步開展ILTV的防控提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒的繁殖與復壯

取本實驗室分離保存的傳染性喉氣管炎病毒BT株(ILTV-BT)病毒液經絨毛尿囊膜途徑(CAM)接種10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，置于37 ℃溫箱中培養5 d，無菌收集有明顯病變的絨毛尿囊膜，無菌研磨后，用滅菌生理鹽水4倍稀釋，經CAM途徑連續傳至10代，按照Reed-Muench法計算雞胚半數感染量(EID50)。無菌分裝后,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 病毒基因擴增及測序

提取第10代出現明顯痘斑的雞胚絨毛尿囊膜DNA，參考GenBank中公布的ILTV目的基因片段核苷酸序列，針對ILTV基因組TK、gB、UL32、ICP4基因設計鑒定及測序引物(請參見OSID相關資料)。以提取所得的DNA為模板對目的片段進行擴增。擴增產物送北京擎科新業生物技術有限公司測序。

1.3 病毒的遺傳進化與分子特征分析

使用DNAStar軟件和Geneious等生物學軟件進行序列拼接和分析；采用MEGA v.6軟件中的Clastal W算法對所有核苷酸序列進行多重序列比對；基于鄰接法(Neighbor Joining method)構建TK、gB、UL32和ICP4串聯基因序列進化樹；采用NetNGlyc在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)分析預測gB及UL32基因的糖基化位點。

1.4 動物回歸致病性試驗

將繁殖復壯后的ILTV-BT株以將104.0EID50·0.2 mL-1的劑量進行喉氣管內回歸接種10只2周齡SPF雞，在14 d的觀察期內，每天觀察雞的臨床癥狀，試驗期結束后，隨機選取3只雞進行剖檢，觀察喉頭及氣管的剖檢變化。同時，另5只SPF雞接種0.2 mL生理鹽水作為空白對照組。

2 結 果

2.1 ILTV-BT株的分離鑒定與相似性分析

經CAM途徑接種SPF雞胚，連續傳代出現穩定胚變，雞胚絨毛尿囊膜增厚，有大小不等不透明白色病斑(圖1A)。使用ILTVgB基因鑒定引物進行PCR擴增，獲得了約1 360 bp大小的片段，與預期相符(圖1B)。測序結果(未展示)顯示，在4個基因中，ICP4基因的變異最大(98.68%～99.96%)，其次為gB基因(99.43%～100.00%)，TK基因(99.63%～100.00%)及UL32基因最為保守(99.89%～100.00%)。BT株與我國經典強毒株WG株的相似性最低(99.43%)，與疫苗株Serva的相似性最高(100.00%)。

M.Trans 5K DNA相對分子質量標準；P.陽性對照；C.陰性對照；BT.傳代毒P10代

2.2 遺傳進化分析與關鍵氨基酸位點

基于串聯基因組的進化樹分析顯示，ILTV毒株具有明顯的地理隔離特征，可分為澳大利亞、歐洲和中國3個主要進化分支，ILTV-BT株與其余國內流行分離株處于同一分支(圖2)。氨基酸比對結果(未展示)顯示，BT株與強毒株WG和1874C5的氨基酸差異主要集中于gB基因和ICP4基因。TK基因與WG株僅有一個氨基酸位點的差異(252T)，gB基因與WG株共有5個氨基酸位點差異，分別為44R、116V、551M、644I和707F，與1874C5株共有4個氨基酸位點差異，分別為116V、644I、799P和805K。有6個潛在的N-糖基化位點(102、121、211、262、360和649位)。UL32基因的441位存在1個潛在的N-糖基化位點。其與WG株在142和227位存在差異。與澳大利亞和美國分離株相比，BT株在ICP4基因87—90位存在4個氨基酸的缺失(AAQD)。其862—868位存在6個氨基酸的缺失(QPQEPQ)。此外，其在1 171位的氨基酸由甘氨酸G突變為谷氨酸E，該突變僅存在于LJS09序列中。

圖2 ILTV-BT株串聯基因組系統進化分析

2.3 ILTV-BT株動物回歸致病性

在感染組接種后14 d觀察期內未觀察到呼吸道癥狀及死亡，僅觀察到少量雞出現精神沉郁及眼結膜分泌物，2～3 d后逐漸恢復(圖3A、B)。剖檢結果顯示喉頭氣管正常(圖3C、D)。空白對照組在整個試驗觀察期內未表現出任何臨床癥狀，剖檢顯示喉頭氣管正常。

圖3 ILTV-BT株感染雞臨床觀察及氣管剖檢

3 討 論

本研究中，BT株核苷酸序列與國內其他流行毒株相似性在97%以上，屬于同一進化分支，未出現較大變異。但其與美國強毒株1874C5和國內標準株WG株等毒株差異較大，主要集中于gB和ICP4基因。gB基因與國內強毒株WG株的相似性最低，包含5個氨基酸位點的差異(44R、116V、551M、644I和707F)，而與弱毒疫苗株的相似性更高；WG株與國外強毒株如美國632強毒株、英國Throne強毒株的基因序列相似性為100%[12]，因此上述位點的差異可能為強毒株與弱毒株之間的毒力差異位點，并值得進一步研究；ILTV-BT株ICP4基因與美國強毒株1874C5和WG株等毒株差異也較大，有文獻表明ICP4基因發生突變可能影響病毒毒力水平[9]。與國外分離株相比，BT株在87—90位和862—868位存在氨基酸缺失，文獻報道這兩個關鍵的氨基酸序列缺失可以減弱ICP4基因激活基因的表達，因此能夠抑制潛伏感染的病毒重新活化[13]。ILTV-BT株的核苷酸序列與美國疫苗株Serva的同源性最高，而與澳大利亞疫苗株SA2和A20親緣關系較遠。不同地區之間分離株的差異也可能與所使用疫苗株來源的不同有關。

為了評估分離株對SPF雞的致病性，筆者將ILTV-BT株感染2周齡SPF雞，研究結果發現分離株可引起少量雞出現精神沉郁及眼結膜癥狀，但沒有出現雞死亡。說明分離株對SPF雞有一定的致病性，但致病力較溫和。這也可能是造成類似低毒力毒株在雞群中廣泛傳播和流行的原因。

4 結 論

通過對1株ILTV國內分離株進行部分基因序列測定分析及2周齡SPF雞致病性研究，作者發現國內ILTV流行株以較溫和的形式在雞群中流行，并呈現出與近年來國外分離株不同的獨特基因序列特征。