玉米赤霉烯酮致PC12細胞自噬流阻滯的相關作用機制

曹倩穎，鄭 豪，王婭玲，鄒 輝，顧建紅，袁 燕，劉學忠，劉宗平，卞建春*

(1.揚州大學獸醫學院，揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是禾谷鐮刀菌屬霉菌通過聚酮途徑生物合成的非甾體雌激素類真菌毒素，是谷物和谷類產品中最常見的污染物之一，對食品安全構成嚴重威脅[1]。研究表明，ZEA及其代謝物具有生殖毒性、遺傳毒性、免疫毒性以及致癌性等。近年來，關于ZEA的生殖毒性研究較為廣泛，因其化學結構與雌激素相似，因而具有與雌激素受體結合的能力和生物蓄積能力，從而可能導致多種生殖系統疾病[2]。ZEA對神經系統也存在毒性作用，但相關研究尤其是對其作用機制的研究卻相當有限。有研究表明，ZEA對人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞和斑馬魚胚胎神經發育具有毒性作用[3]，相關毒性機制與氧化應激有關[4]。氧化應激中產生的ROS是自噬的重要調節因子，它能誘導自噬發生[5]。細胞自噬是真核細胞內一種高度保守的溶酶體依賴的分解代謝過程。本課題組前期研究證明，ZEA可誘導原代大鼠間質細胞自噬的發生[6]。且在一定濃度范圍內，ZEA可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導大鼠睪丸支持細胞自噬的發生[7]。而在豬的子宮內膜細胞中，ZEA可激活自噬，并阻斷自噬流，導致大量自噬體的積聚[8]。但目前尚未有研究表明ZEA所致的神經毒性作用是否與自噬相關。PC12細胞來源于一種可移植的鼠嗜鉻細胞瘤的細胞株，具有神經內分泌細胞的一般特征，廣泛用于神經系統疾病體外研究。本研究采用PC12細胞為研究對象，以不同濃度的ZEA處理細胞，探究ZEA暴露對神經系統的影響及其毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞株

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系(PC12細胞)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

玉米赤霉烯酮標準品、RPMI 1640培養基(美國Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司)，RIPA強裂解液、蛋白酶抑制劑(北京普利萊基因技術有限公司)，LC3(3868)、p62(5114)、Atg5(9980)、Beclin-1(3495)、Cathepsin D(69854)、Cathepsin B(31718)兔單克隆抗體(美國CST公司)，LAMP-1(20011)鼠單克隆抗體(Santa公司)，SNAP29(12704-1-AP)、STX-17(17815-1-AP)、TFEB(13372-1-AP)兔多克隆抗體(武漢Proteintech公司)，其余試劑均為國產分析純級。

IM-AGEQUAMT 400型凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、轉膜儀(美國BIORAD公司)，FACS Aria型流式細胞儀(美國Becton-Dick-inson公司)，5810 R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)，Milli-Q Biocel型超純水系統(美國 Millipore公司)，WYJ-875 B型醫用凈化工作臺(蘇州金燕凈化設備廠)，超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 細胞培養與處理

PC12細胞接種于RPMI 1640培養基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養，將對數生長期的細胞分別設置為Con組(二甲基亞砜處理組)、15及30 μmol·L-1(由二甲基亞砜配制)ZEA組，染毒時間為24 h。

1.4 CCK-8法檢測PC12細胞存活率

用0.25%胰酶消化細胞，收集細胞懸液以5×103個·100 μL-1的細胞密度將PC12細胞接種于96孔培養板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。分為Con組、ZEA 處理組(15、30 μmol·L-1)，每組設6個重復。空白對照組加入等量PBS，Con組加等量細胞培養基。染毒24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h后，將96孔板置于全自動酶標儀中，于450 nm波長下測定各孔光吸收值(OD450 nm)，細胞的存活率=(試驗組OD450 nm-空白對照組OD450 nm)/(陰性對照組OD450 nm-空白對照組OD450 nm)×100%。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

將對數生長期的PC12細胞分為Con組、ZEA處理組(15、30 μmol·L-1)，棄去培養基上清液，用預冷的PBS清洗1～2次，吸凈余液，加入裂解液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑=100∶1)100 μL，刮取細胞至1.5 mL EP管中，標記組別，于4 ℃裂解30 min，超聲破碎細胞20 s，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min后吸取上清液。使用BCA試劑盒測定各組別蛋白濃度，并用裂解液將各組蛋白質濃度調至一致，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水浴使之變性10 min，置于-80 ℃保存。進行Western blot試驗時，將蛋白樣品室溫溶解，按照每孔10 μL上樣量進行SDS電泳。電泳分離后，將蛋白轉印至PVDF膜上，用5%的脫脂乳作為封閉液，室溫封閉1.5～2.0 h，封閉結束后TBST清洗，根據試驗設計將PVDF膜加入相應蛋白的一抗稀釋液中，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌5次，每次5 min。根據一抗選擇對應的二抗孵育2 h，TBST洗滌5次，用顯影儀進行顯影。

1.6 mRFP-GFP-LC3檢測自噬流

待細胞密度長到50%左右的時候，根據mRFP-GFP-LC3的MOI(感染復數)值，配制所需工作液。加入培養皿體積1/2的工作液后，將細胞移至37 ℃培養箱進行培養，所有操作均需避光。培養6 h后，補充培養基至培養皿的正常體系。

1.7 AO染色觀察ZEA對PC12細胞酸性環境的影響

取對數生長期的PC12細胞接種于含有爬片的6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養箱培養，24 h后更換培養液，試驗設置Con組、不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)處理組，以1 μg·mL-1吖啶橙避光染色15 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 免疫熒光檢測LC3、TFEB定位情況

將細胞接種于24孔板中，以不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)作用PC12細胞24 h。棄去培養液，使用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定30 min，PBS洗滌2次，0.5% TritonX-100室溫條件下固定20 min，PBS洗滌2次，以50 g·L-1BSA室溫封閉30 min后，加入一抗，在4 ℃條件下孵育12 h；PBS洗滌3次后，加入二抗作用1 h，PBS洗滌3次，加入DAPI作用15 min，再次使用PBS洗滌3次后,加入防熒光淬滅劑，封片處理，使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，選擇有代表性的細胞并拍照。

1.9 數據的處理與統計分析

應用SPSS 22.0統計軟件對數據進行顯著性t檢驗和單因素方差(ANOVA)分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 ZEA對PC12細胞存活率的影響

將處于對數期的細胞分別設置為Con組、ZEA處理組，本課題組前期研究中，關于ZEA處理使生殖細胞發生自噬的作用濃度多為20 μmol·L-1，而ZEA對神經系統的毒性作用弱于生殖系統，為探究ZEA使PC12細胞發生自噬的最佳濃度范圍，使用CCK-8對不同濃度的ZEA(7.5、15.0、30.0、45.0 μmol·L-1)進行篩選，每組設6個重復，染毒處理24 h后，使用CCK-8檢測細胞活力。結果如圖1所示，與對照組相比，15 μmol·L-1及以上濃度ZEA染毒組細胞活力顯著下降(P<0.05)，而45 μmol·L-1的ZEA組細胞存活率低于50%，細胞死亡率過高將會影響試驗結果，因此將采用15、30 μmol·L-1進行后續試驗。

*.P<0.05，下同

2.2 ZEA對PC12細胞自噬相關蛋白表達水平的影響

取對數期PC12細胞，用不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)處理24 h后，Western blot檢測自噬相關蛋白ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62表達水平。結果如圖2所示，與對照組相比，15、30 μmol·L-1的ZEA處理組ATG5、LC3 Ⅱ、p62表達水平均顯著上升(P<0.05)，30 μmol·L-1的ZEA組Beclin1表達水平顯著上升(P<0.05)，結果表明，ZEA可引起PC12細胞自噬體增加及自噬水平升高。

A.蛋白印跡檢測ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62蛋白表達水平；B.灰度分析ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62相對蛋白水平

2.3 ZEA對PC12細胞自噬體生成的影響

自噬體的形成是自噬過程必不可少的階段。通過免疫熒光檢測定位于自噬體的LC3，結果如圖3所示，與對照組相比，ZEA不同濃度處理組都呈現LC3熒光聚點增加的情況，表明PC12細胞自噬體生成增加，提示ZEA可引起PC12細胞自噬水平升高。

免疫熒光檢測LC3標記的自噬體定位情況

2.4 ZEA對PC12細胞自噬流的影響

mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒轉染PC12細胞后，不同劑量ZEA(15、30 μmol·L-1)處理PC12細胞，mRFP用于標記及追蹤LC3，GFP的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體，由于GFP熒光蛋白對酸性敏感，當自噬體溶酶體融合后，GFP熒光發生淬滅，只能檢測到紅色熒光，即紅綠熒光融合后出現的紅色斑點指示自噬溶酶體，黃色斑點為自噬體，通過共聚焦顯微鏡可對此進行觀察，結果如圖4所示，Con組呈現出彌散的黃色熒光，隨著染毒濃度的增加，觀察到黃色熒光聚點明顯增多，紅色熒光聚點幾乎不可見，15 μmol·L-1ZEA組最為明顯，提示LC3定位于自噬體內，表明ZEA處理使PC12細胞發生自噬流阻滯。

mRFP-GFP-LC3雙標腺病毒轉染PC12細胞檢測自噬流

2.5 AO染色觀察細胞內溶酶體狀態

吖啶橙是一種親溶酶體劑，也是一種熒光素，可透過正常細胞膜蓄積在細胞內的酸性結構中，常用來檢測溶酶體的功能狀態。AO在具有酸性環境的溶酶體中處于高濃度狀態，而在細胞質和核中處于低濃度狀態，溶酶體中的AO呈紅色熒光，細胞質和細胞核中的AO呈綠色熒光。結果如圖5所示，對照組即正常培養條件下PC12細胞內可見明顯的紅色熒光斑點，體現PC12細胞內基礎水平的溶酶體，隨著ZEA染毒濃度的增加，紅色熒光減少,綠色熒光稍有增強，30 μmol·L-1ZEA組紅色熒光幾乎不可見，表明溶酶體受到損害，膜通透化且數量減少，提示ZEA可能通過損傷溶酶體來阻礙自噬流。

圖5 AO染色觀察細胞內溶酶體狀態

2.6 ZEA對PC12細胞溶酶體相關膜蛋白及組織蛋白酶蛋白表達水平的影響

細胞自噬是真核細胞內一種高度保守的溶酶體依賴的分解代謝過程。溶酶體的正常運作是維持自噬通量的重要保障。前期試驗證明，ZEA可能通過損傷溶酶體來阻礙自噬通量，下步試驗將驗證ZEA是否會對PC12細胞溶酶體產生損傷。

LAMP1是溶酶體的標志蛋白，通常通過檢測LAMP1來識別溶酶體。溶酶體內含多種水解酶，組織蛋白酶是其中之一，其具有多種生物活性,是哺乳動物體內蛋白水解的主要參與者。而本試驗檢測的是細胞質中CTSB和CTSD的表達水平。在本研究中，對照組及ZEA組(15、30 μmol·L-1)處理24 h后，Western blot檢測LAMP1、CTSB、CTSD蛋白表達水平。結果如圖6所示，與對照組相比，隨著ZEA染毒濃度增高，CTSD表達水平顯著升高(P<0.05)，CTSB表達水平在ZEA為30 μmol·L-1時顯著升高(P<0.05)，LAMP1表達水平在ZEA為30 μmol·L-1時顯著下降(P<0.05)。有研究報道，LAMP1蛋白在維持溶酶體膜結構穩定性方面起著重要作用[9]，其表達水平降低時將影響細胞自噬功能。表明ZEA可能通過降低LAMP1蛋白水平來對溶酶體造成損傷，同時原本位于溶酶體內的CTSB和CTSD在細胞質中表達升高意味著溶酶體受到損害導致CTSB和CTSD流入細胞質中，進一步證實ZEA可對溶酶體造成損傷。

A.蛋白印跡檢測LAMP1、CTSB、CTSD蛋白表達水平；B.灰度分析LAMP1、CTSB、CTSD相對蛋白水平

2.7 ZEA對PC12細胞中TFEB蛋白的表達及入核的影響

TFEB是自噬-溶酶體途徑(ALP)的主要轉錄調節因子，它積極調節自噬和溶酶體生物發生相關基因的表達，從而促進自噬體的形成、自噬體-溶酶體的融合和自噬底物的降解[10]。ERK(細胞外調節蛋白激酶)，是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵，磷酸化激活的ERK由細胞質轉移到核內，調節轉錄因子活性。不同濃度ZEA(15、30 μmol·L-1)處理PC12細胞24 h后，Western blot檢測ERK、p-ERK、胞質及核內TFEB蛋白表達水平，結果如圖7所示，與對照組相比，隨著ZEA濃度增高，p-ERK蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，30 μmol·L-1ZEA組核內TFEB蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，而細胞質內TFEB表達水平未見顯著性變化。ERK通過磷酸化激活進而由胞質轉移到核內來調節TFEB的活性，與此一致，p-ERK表達水平的顯著下降伴隨著核內TFEB表達水平得顯著下降，表明ZEA可能通過阻礙ERK的激活來影響TFEB的轉錄活性，也表明ZEA對PC12細胞TFEB蛋白的入核起抑制作用，進而影響溶酶體功能和自噬通量。同時使用免疫熒光檢測TFEB的入核表達情況，結果如圖7所示,對照組細胞TFEB入核明顯，細胞核內綠色熒光與藍色熒光聚集，呈現比細胞核稍淺的淡藍色熒光，隨著ZEA染毒濃度的增高，TFEB在細胞核內定位減少，所以細胞核內藍色熒光強度明顯比對照組加深，表明TFEB入核受到抑制，與Western blot結果一致。

A.蛋白印跡檢測ERK、p-ERK、TFEB在細胞質及核內蛋白表達水平；B.灰度分析p-ERK、TFEB在細胞質及核內相對蛋白水平；C.免疫熒光檢測TFEB入核情況

2.8 ZEA對PC12細胞自噬溶酶體融合相關蛋白的影響

自噬的最后一步是自噬體與溶酶體的融合，這是由SNARE蛋白介導的，SNARE蛋白中涉及自噬體定位的Q-SNARE，如STX17和SNAP29對自噬體與溶酶體的融合起重要作用[11]。本研究用不同劑量ZEA(15、30 μmol·L-1)處理 PC12 細胞后，Western blot 檢測自噬體與溶酶體融合關鍵蛋白SNAP29、STX17蛋白表達水平。結果如圖8所示，與對照組相比，隨著ZEA染毒濃度增加，SNAP29、STX17 蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，表明ZEA可通過影響自噬體與溶酶體的融合來阻礙自噬流。

A.蛋白印跡檢測SNAP29、STX17蛋白表達水平；B.灰度分析SNAP29、STX17相對蛋白水平

3 討 論

細胞自噬是進化上高度保守的，針對胞內成分再循環的溶酶體降解過程。細胞自噬幫助清除受損的細胞器、蛋白聚集體和生物大分子，實現細胞物質的循環與再利用，以維持細胞穩態[12]。在自噬過程中，細胞質物質被自噬體(一種雙膜結構)隔離，并被運送到溶酶體進行消化[13]。自噬體的形成受到一組自噬相關蛋白的嚴格調控。其中，LC3是自噬體形成所必需的[14]，也是公認的自噬標志物。自噬被誘導及自噬流被阻斷均可引起LC3升高，同時p62升高是自噬流阻斷的一個很好的指示標志[15]。本試驗對自噬相關蛋白表達水平分析顯示，LC3 Ⅱ、p62、ATG5及Beclin1表達均增加，提示ZEA誘導PC12細胞發生自噬，而細胞內LC3 Ⅱ增加可能與其阻斷自噬流有關，免疫熒光試驗中LC3熒光聚點增多也提示自噬體增多。為進一步驗證，作者使用mRFP-GFP-LC3檢測自噬流，由于GFP對酸性敏感，GFP的減弱可指示自噬流活化，當LC3定位于酸性環境的自噬溶酶體時只表現紅色熒光，定位于自噬體時呈黃色熒光，觀察發現紅色熒光的量明顯少于黃色熒光的量，即自噬流阻滯。試驗結果表明，ZEA誘導PC12細胞自噬涉及自噬流阻滯。

為探究ZEA致PC12細胞自噬流阻滯的機制，本試驗采用AO染色觀察了具有酸性環境的溶酶體生成情況。AO染色中胞核和胞質呈綠色熒光，其聚集在酸性隔室時呈紅色熒光，當紅光減弱，綠光增強時，提示環境中pH升高且溶酶體膜通透化，結果證明ZEA處理使溶酶體數量降低伴隨膜通透化。隨后，本試驗檢測了自噬體與溶酶體融合階段所必需的蛋白LAMP1[16]及細胞質起蛋白水解作用的CTSB、CTSD[17]蛋白表達水平，發現細胞質中CTSB和CTSD表達呈不同程度的增高，即溶酶體受到損傷，蛋白水解酶由溶酶體進入細胞質，進而影響了溶酶體的降解能力。Song等[18]研究發現，鉛可通過影響CTSB和CTSD的成熟來抑制溶酶體的降解能力，這與本試驗結果一致。

TFEB是自噬-溶酶體途徑的主要轉錄調節因子，可通過調節自噬相關基因的表達，從而調節自噬體的生成和自噬溶酶體的融合等過程[19]。此外TFEB還參與溶酶體的生物發生和胞吐，通過促進溶酶體基因的表達來調節自噬溶酶體的產生和外排功能[10]。本研究通過檢測p-ERK及TFEB在核內外的表達水平，發現p-ERK及核內TFEB蛋白表達下降，而胞質內TFEB未見顯著變化。p-ERK從細胞質轉移到核內調節TFEB的活性，ZEA影響TFEB的轉錄活性可能通過阻礙ERK的激活來實現，也表明ZEA對TFEB的入核起抑制作用。免疫熒光試驗結果也證實ZEA暴露后TFEB入核減少，提示ZEA可能通過抑制TFEB的入核來阻滯自噬流。

在自噬過程中，自噬體和溶酶體的融合是完全降解必不可少的，自噬體的早期生物發生和溶酶體的晚期降解都需要膜融合活性[20]。自噬體通過與溶酶體融合，將細胞內部待消化的物質完全包裹后送入溶酶體中才得以降解并實現循環利用。自噬小體定位的STX17、SNAP29和溶酶體定位的VAMP8或VAMP7被認為是參與融合過程的關鍵因素[11]。自噬啟動過程中，STX17轉位到自噬體，與SNAP29形成二元復合物，然后STX17-SNAP29與溶酶體Vamp8相互作用形成膜復合物，促進自噬體-溶酶體融合[21]。本研究中STX17及SNAP29的蛋白表達量均降低，ZEA可能通過抑制STX17及SNAP29的表達及結合過程來阻礙自噬溶酶體的膜融合，進而阻滯自噬流。

4 結 論

ZEA暴露對溶酶體造成了損傷，影響了其數量及降解功能，抑制了TFEB入核過程，降低了自噬溶酶體融合蛋白表達水平，引起自噬流阻滯，而自噬體無法正常降解會堆積在細胞內，造成自噬體數量增多的現象，最終導致細胞內代謝紊亂，提示自噬流阻滯參與了ZEA對PC12細胞的神經毒性作用。本研究為進一步揭示ZEA對神經系統毒性作用機制提供了重要科學依據。