NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在犬乳腺腫瘤組織中的表達

李 妍,藍婷英,龐 博,楊曉農,2,黃 堅,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041；2.西南民族大學教學動物醫院，成都 610041)

乳腺腫瘤為母犬最常見的腫瘤疾病之一，其惡性特征和不良預后與炎癥信號分子的關系緊密[1]。在乳腺腫瘤發生的過程中，炎癥相關免疫細胞(如巨噬細胞)可通過釋放和激活炎癥信號相關因子促進乳腺組織發生惡變[2]，而這已成為目前臨床抗腫瘤治療的研究靶點之一[3]。隨著研究的深入，一些新的炎癥信號因子被聚焦，而核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NLRP3)炎癥小體是近年來炎性疾病和腫瘤醫學研究的熱點之一，活化后的NLRP3炎癥小體通過控制多級促炎性細胞因子(Caspase-1、IL-1β和IL-18)的成熟與分泌來調節腫瘤微環境，誘導組織細胞的DNA氧化損傷并發生失控性增殖，促進腫瘤的形成和發展[4]。由于犬乳腺腫瘤臨床特征的多樣性以及疾病背景的差異化，NLRP3炎癥小體作為診斷標記的臨床研究數據仍然缺乏。因此，本研究將采用RT-qPCR檢測結合組織病理學評價的方法，分析NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的表達模式以及與犬乳腺腫瘤臨床病理學特征的關系，為其作為潛在的分子診斷靶標提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣本資料

45份犬乳腺腫瘤樣本采自2018年11月—2020年1月在西南民族大學教學動物醫院接受腫瘤切除術的患犬。同時，另取16份不重復的腫瘤旁正常乳腺組織作為對照。所有犬在手術前均接受胸部X線檢查(排除可見的肺部轉移灶)、腹部超聲檢查(檢查是否有腹內轉移灶)及相關術前評估。同時，登記患犬和腫瘤的信息，并在術后連續回訪12個月，記錄病例的預后情況。無菌采集患犬的乳腺腫瘤組織及部分腫瘤旁正常乳腺組織(辨別標準：眼觀無異常形態變化，組織病理學顯示為正常的乳腺組織結構)，將樣本無菌剪切為約0.5 cm3大小的組織塊，并用4%多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋和組織切片的制作。另外從同一病例中另取約0.3 cm3的組織樣本，經液氮速凍后，放入凍存管中，于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol試劑、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、PrimeScriptTMfirst Strand cDNA合成試劑盒、DNA聚合酶、pMD19-T克隆載體、DH5ɑ感受態細胞等購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產物純化和質粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司；石蠟、二甲苯、乙醇、蘇木素、伊紅染液、4%多聚甲醛及中性樹膠等均為國產試劑；QuantStudio 3熒光定量PCR儀購自美國ABI。

1.3 病理組織切片制備和評價

將固定完成的組織樣本修整后，用PBS徹底浸洗，然后經梯度濃度乙醇脫水后，置入系列二甲苯中透明。將透明好的組織塊充分浸蠟，而后包埋置于室溫冷卻。將獲得的組織蠟塊上機連續切片(厚度為4 μm)，并按照HE染色方法進行染片和用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。根據Goldschmidt 等[5]推薦的分類標準對犬乳腺腫瘤進行組織分型和惡性分級。

1.4 RNA提取和RT-qPCR反應

采用Trizol法提取組織中的RNA，按照試劑盒操作說明反轉錄為cDNA，于-80 ℃保存備用。根據GenBank收錄的基因序列，利用Primer premier 6.0軟件設計RT-qPCR基因檢測的特異性引物序列，并送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。NLRP3(XM_00843 284.2)，上游引物：5′-GCAACAGTGTGAGGTGAGGCTAC-3′，下游引物：5′-TGCAATGCTCTTGGAGACACAGG-3′，產物長度為114 bp；Caspase-1(NM_001003125.1)，上游引物：5′-TCCTTCTAGGTGACAGCACCA-3′，下游引物：5′-TTCTGCTCCTCAACCCCACA-3′，產物長度為117 bp；IL-1β(NM_001037971.1)，上游引物：5′-CTCCAGGAGGATGACCTGAAGAGC-3′，下游引物：5′-TGTAACTTGCAGTCCACCGATTGC-3′，產物長度為125 bp；IL-18(XM_005619483.1)，上游引物：5′-TGGCCTGGAACACTTCTCTGA-3′，下游引物：5′-AGCCTCACTAGAGGTCTGGC-3′，產物長度為164 bp；以β-actin(XM_025468289.1)為內參基因，上游引物：5′-GCTACAGCTTCACCACCACTGC-3′，下游引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3′，產物長度為94 bp。將擴增得到特異性產物經瓊脂糖凝膠電泳和測序驗證后，克隆轉化和構建質粒標準品，將cDNA經梯度稀釋后進行RT-qPCR擴增，并根據結果繪制標準曲線和熔解曲線。RT-qPCR反應體系為TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，最后用ddH2O補足至20 μL。反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性2 min：以優化后的退火溫度延伸30 s，反應結束后溫度降到60 ℃再以0.15 ℃·s-1升溫至95 ℃，共40個循環。采用2—ΔΔCt法，以腫瘤旁正常乳腺(ANMGs)為對照，對良性腫瘤(BCMTs)和惡性腫瘤(MCMTs)目標基因的相對表達量進行計算。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 組織病理學分型和分級結果

對收集的45份犬乳腺腫瘤樣本進行組織病理學分類，其中15例為良性腫瘤(CBMTs)，30例為惡性腫瘤(CMMTs)。良性腫瘤包括復合型腺瘤6例、導管型腺瘤4例、肌上皮瘤4例、簡單型腺瘤1例；惡性腫瘤包括惡性肌上皮瘤10例、混合性癌6例、實體瘤5例、炎性癌3例、富脂癌2例、管狀癌1例、導管乳頭狀癌1例、微乳頭侵潤性癌1例和未分化癌1例。惡性腫瘤中，6例為惡性一級(占比20%)，12例為惡性二級(占比40%)，12例為惡性三級(占比40%)(圖1)。

A.腫瘤旁正常乳腺：小葉增生(小葉內腺管增多)；B.良性腺瘤(腺管內有分界明顯的立方或柱狀上皮細胞增殖，細胞分化良好)；C.混合性癌(惡性一級)(惡性上皮細胞在乳腺腺管的原位增殖，梭形細胞散在分布于黏液樣基質內)；D.實體瘤(惡性二級)(細胞核深染、細胞質少，細胞呈實心樣緊密排列呈無腺管結構的小葉外觀)；E.炎性癌(惡性三級)(皮膚淋巴管內有大量的侵潤性腫瘤細胞)；F.惡性肌上皮瘤(惡性三級)(無腺管結構，大量卵圓形或梭形肌上皮細胞增殖，細胞間有黏液樣基質散在分布)

2.2 乳腺組織中NLRP3及下游炎癥因子的基因轉錄差異分析

目標基因和內參基因的凝膠電泳圖結果顯示，在預期大小位置獲得清晰的單一擴增條帶(圖2)，經測序驗證均為目標基因序列。各目標基因擴增曲線的相關系數(R2)均大于0.989，標準曲線可信度高，擴增效率相近。所有基因擴增的熔解曲線均為單峰，產物特異性高。

A.NLRP3；B.Caspase-1；C.IL-1β；D.IL-18；E.β-actin；M.DNA相對分子質量標準；—.陰性對照

與對照組(腫瘤旁正常乳腺，ANMGs)相比，良性乳腺腫瘤和惡性乳腺腫瘤組織中的NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的相對轉錄量均存在不同程度的差異(圖3)。其中，惡性腫瘤的NLRP3轉錄量要顯著高于對照組和良性腫瘤組[ANMGs(1.719±1.398)vsCBMTs(2.448±1.737)vsCMMTs(7.747±6.881)](P值分別為0.001和0.006)，而Caspase-1[ANMGs(2.353±2.005)vsCBMTs(4.467±4.646)vsCMMTs(10.150±9.931)](P值分別為0.001和0.048)在組間的表達結果與NLRP3的一致。惡性腫瘤和良性腫瘤的IL-1β表達量要顯著高于對照組[ANMGs(4.415±9.086)vsCBMTs(36.91±36.67)vsCMMTs(51.65±61.32)](P值分別為0.004和0.002)，而IL-18的轉錄量僅在惡性腫瘤和對照組中存在顯著差異[ANMGs(3.734±4.444)vsCBMTs(9.529 ±14.420)vsCMMTs(14.950±16.850)](P值為0.013)。在30例惡性腫瘤組織中，僅Ⅲ級的NLRP3的轉錄量顯著高于Ⅰ級和Ⅱ級的表達量[Grade I(3.079±2.100)vsGrade Ⅱ(5.705±6.313)vsGrade Ⅲ(11.930 ± 6.852)](P值分別為0.008和0.030)，其他因子在各組間均無差異(圖4)。

A.NLRP3; B.Caspase-1; C.IL-1β; D.IL-18.*.P<0.05；**.P<0.01

*.P<0.05

2.3 NLRP3的表達與犬惡性乳腺腫瘤的臨床病理學特征的關系

以CMMTs 中NLRP3相對表達量的中位數作為分界點將其分為高表達和低表達組，統計分析結果顯示，NLRP3的轉錄表達與腫瘤類型(P=0.029)和惡性等級(P=0.049)關系緊密，而與腫瘤大小和手術預后指標無統計學關系，見表1。

表1 NLRP3的相對轉錄量與犬惡性乳腺腫瘤的臨床病理學特征關系

3 討 論

NLRP3炎癥小體作為腫瘤組織微環境穩態和炎癥反應的關鍵調控因子，其在腫瘤發展過程中的異常激活可促成炎癥反應的級聯放大，并進一步引起腫瘤細胞的失控性增殖和轉移[3]。本研究首次對犬乳腺腫瘤中的NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子的表達模式與腫瘤的臨床病理學特征關系進行了分析，明確了上述因子在組織腫瘤化和腫瘤惡變時表達出現不同程度的上調，與部分人類腫瘤的相關研究結果一致[6-7]，表明NLRP3炎癥小體及相關炎癥因子的表達失調是犬乳腺腫瘤發生發展的風險因素。NLRP3和Caspase-1在腫瘤旁正常乳腺組織、良性腫瘤和惡性腫瘤中呈現遞增式表達上調，說明這些炎癥因子可能參與促進了乳腺組織腫瘤化和惡變過程。此外，下游的IL-1β和IL-18的表達并未出現一致的變化趨勢，這可能與腫瘤中的炎癥反應存在多重調控通路有關[4]。He等[8]在人宮頸癌細胞中發現TLR4-NF-κB和NLRP3炎癥小體信號通路均可介導LPS誘導的IL-1β激活，而Ranson等[9]也證實NLRP3依賴性和非依賴性激活的IL-1β均可促進活動性結腸炎的發病進程。此外，腫瘤相關巨噬細胞和成纖維細胞中的NLRP3炎癥小體也可誘導IL-1β和IL-18可通過旁分泌或自分泌的方式促進腫瘤的增殖和轉移[10-12]，綜合這些結果反映出NLRP3炎癥小體及下游炎癥因子可通過腫瘤微環境中的多信號軸交聯來介導的腫瘤發生和發展。

根據Wang 等[7]報道，NLRP3炎癥小體可促進人口腔鱗狀上皮癌的生長和轉移，而另一份對人肝癌的臨床調查結果卻發現肝癌組織中的NLRP3炎癥小體表達出現下調，且與臨床分期和病理分級呈負相關[13]，這些不一致的結果提示，NLRP3炎癥小體在不同腫瘤疾病中可能發揮促進或抑制腫瘤發生的作用[14-15]。本研究中，混合性癌和實體癌的NLRP3炎癥小體顯著高表達，而其他類型的腫瘤中則多呈現低表達，提示NLRP3在不同類型的乳腺腫瘤發展進程中的生物學作用也并不一致。因此，有必要進一步研究NLRP3炎癥小體表達與腫瘤疾病背景的關系。此外，NLRP3炎癥小體在高惡性等級乳腺腫瘤中的表達顯著上調，說明了NLRP3炎癥小體的高表達可促成腫瘤的進一步惡變。綜上可知，NLRP3炎癥小體與犬乳腺腫瘤的發生發展關系緊密，可作為該類疾病臨床評估和預后的重要指標之一。

4 結 論

NLRP3炎癥小體的表達上調可能導致犬乳腺組織發生腫瘤化和腫瘤惡變，是疾病診斷和惡性特征評估的重要指標之一。