非洲豬瘟病毒全長與截短p72蛋白的抗原性比較

張文燕，王亞文，馮亞文，滕召劍，李潭清，董 煒，劉 濤，宋勤葉*，任玉紅*

(1.河北農業大學動物醫學院&河北省獸醫生物技術創新中心，保定 071000；2.河北省獸藥監察所，石家莊 050051；3.順平縣動物疫病預防與控制中心，保定 072250；4.瑞普生物藥業有限公司，保定 071000)

非洲豬瘟(Africa swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africa swine fever virus, ASFV)引起豬和野豬的一種高度接觸傳染性的烈性傳染病，以全身組織器官廣泛出血、脾急性腫大呈黑色為主要特征，病死率高達100%[1-2]。世界動物衛生組織(OIE)將該病列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。2018年8月我國遼寧沈陽市首次發生ASF疫情，隨后在全國范圍內迅速傳播，給我國養豬業造成極其巨大的經濟損失[3]。

ASFV是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的成員，也是目前發現的可以在軟蜱體內復制的唯一蟲媒DNA病毒[4]。ASFV為雙股DNA病毒，病毒粒子外周直徑約200 nm，結構復雜，由含病毒基因組DNA的擬核、內核芯殼(基質層)、內囊膜、二十面體對稱的衣殼和外囊膜5部分組成[5]。病毒基因組170～193 kb，有151～167個開放閱讀框(ORFs)，編碼150～200種蛋白，其中p72與p30、p54、p12等蛋白抗原性好，可用于ASF的血清學診斷[6-7]。p72蛋白(73.2 ku)由B646L基因編碼，在病毒感染晚期表達，是ASFV衣殼的主要組成部分，占病毒粒子總質量的33%，并且該蛋白在不同ASFV毒株之間高度保守[6]。因此，p72是ASFV病原學和血清學診斷以及流行毒株遺傳進化分析的首選靶標。

目前尚無有效的商品化疫苗和藥物用于ASF的預防與治療，加強檢疫、早期發現和快速確診是當前防控ASF的主要措施[8-11]。本研究體外表達了全長和截短的p72蛋白，分析比較了兩者的免疫原性和反應原性，旨在為建立敏感、特異的ASFV抗體檢測方法提供必要實驗材料。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株與實驗動物

pET-28a(+)原核表達質粒、E.coliDH5α和Rosetta(DE3)感受態細胞，均由河北農業大學傳染病實驗室保存；SPF級BALB/c小鼠，購于河北醫科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑和血清

T4 DNA連接酶，購自美國Promega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司；HRP標記的(HRP-)山羊抗兔IgG(H+L)、抗His標簽的兔多克隆抗體及Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司；HRP-標記的羊抗豬IgG，購自北京索萊寶生物技術有限公司；限制性內切酶XhoⅠ和EcoR Ⅰ，購自寶生物工程(大連)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和IPTG，購自美國Sigma公司；ASFV-ELISA抗體檢測試劑盒為法國愛迪威(ID.Vet)產品；ASFV基因II型毒株抗體陽性、陰性豬血清，由河北驥才中科基因技術有限公司提供；豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)抗體陽性血清，為IDEXX公司產品；豬圓環病毒2型(PCV2)抗體陽性血清，由本實驗室制備并保存。

1.3 基因序列合成與引物設計

ASFV中國分離株Pig/HLJ/2018(GenBank ID: MK333180)的p72基因序列及其重組質粒(T-p72)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成與構建。利用Primer 5.0軟件設計2對帶有酶切位點EcoR Ⅰ和XhoⅠ的引物，分別用于擴增p72全基因和截短基因(p72s)(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR擴增全長p72和截短p72(p72s)基因用引物

1.4 重組表達載體的構建與鑒定

以T-p72重組質粒為模板，分別用引物eU-p72-eL-p72和eU-p72s-eL-p72s，經PCR擴增p72基因和截短基因p72s。PCR反應體系(50 μL)如下：2×Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 22 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，按照瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說明，回收PCR產物，用于重組表達質粒構建。

用限制性核酸內切酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切p72、p72s基因及原核表達載體pET-28a(+)2 h；回收目的DNA片段和質粒；將目的基因分別插入到pET-28a(+)載體中，得到重組質粒pET-28a-p72和pET-28a-p72s，進一步經PCR和酶切(EcoR Ⅰ和XhoⅠ)鑒定后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

1.5 重組蛋白的表達與純化

將構建的重組表達質粒 pET-28a-p72 和pET-28a-p72s分別轉化Rosetta(DE3)感受態細胞，37 ℃培養過夜，挑取陽性單菌落，接種于3 mL Kana+/LB液體培養基中，37 ℃活化過夜，按照1∶100的比例接種到8 mL Kan+/LB液體培養基中，37 ℃振搖培養至對數生長期(OD600 nm=0.6～0.8)，加入終濃度為0.1、0.25或0.5 mmol·L-1的IPTG，在18、20、24、26、28、30、32或35 ℃下，誘導表達3、4、5或6 h。離心收集菌體，SDS-PAGE分析，確定蛋白表達的最佳條件。

超聲裂解收集誘導表達的菌體，4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min，分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE，檢測重組蛋白的表達形式。隨后，按照Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒推薦的步驟純化目的蛋白。純化蛋白經濃度遞減(4.5、3.5、2.5、1.5、0.5和0 mol·L-1)的尿素溶液透析復性(每個濃度的尿素溶液內透析8～12 h)。透析結束后，用PEG20000濃縮蛋白液，4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min，收取上清，通過SDS-PAGE檢測與濃度測定后，分裝，凍存于-80 ℃，備用。

1.6 重組蛋白的鑒定

1.6.1 Western blot 用蛋白半干轉印儀將表達的p72或p72s蛋白轉印到PVDF膜上，將膜放入封閉液(含5%脫脂奶粉、0.05% Tween-20的Tris-HCl緩沖液，pH 7.4)中于4 ℃下孵育過夜；棄去封閉液，洗膜；加入兔抗His標簽多克隆抗體(1∶3 000稀釋)，室溫下反應1.5 h；洗膜，加入 HRP-標記的羊抗兔IgG(1∶4 000倍稀釋)，室溫下反應1 h；洗膜，將膜置于DAB顯色液中顯色3 min。

1.6.2 液相色譜-質譜聯用技術鑒定與蛋白抗原表位分析 分別用胰蛋白酶(trypsin)和糜蛋白酶(chymotrypsin)酶解處理純化的重組蛋白(酶與底物質量比為1∶40)；取處理好的樣品通過液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)分析，獲得質譜原始數據；用MaxQuant(Version 1.6.2.10)軟件分析，數據庫檢索與數據匹配，分析蛋白序列。隨后將蛋白的氨基酸序列提交到網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線預測分析表達蛋白的抗原表位。

1.7 蛋白的免疫原性與反應原性檢測

1.7.1 動物接種與特異性抗體檢測 分別取50 μg的重組p72和p72s蛋白與等量弗氏佐劑乳化后，經背部皮下注射BALB/c小鼠，首次免疫時重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，第2、3次免疫時與等體積的弗氏不完全佐劑乳化，共免疫3次，每次免疫間隔2周，每次每只小鼠接種50 μg重組蛋白。第3次免疫后10 d，應用ELISA檢測并比較兩組小鼠的血清特異性抗體效價。ELISA的主要步驟：分別用0.1 μg的p72和p72s蛋白包被酶標板反應孔，37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜；洗滌，加入封閉液于37 ℃封閉1 h后，加入倍比稀釋的p72或p72s蛋白免疫小鼠血清，37 ℃孵育1 h，同時設立未免疫小鼠血清作為陰性對照；洗滌后加入100 μL HRP-標記的羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育45 min；洗滌，加入100 μL TMB底物顯色液，避光反應15 min，終止反應，用酶標儀測定OD450 nm值。當樣本OD值≥0.3時，判為p72或p72s特異性抗體陽性。

為了分析基于全長和截短p72蛋白ELISA檢測結果的一致性，分別用p72-ELISA和p72s-ELISA檢測108份豬血清，同時設立CSFV、PRRSV、PRV、PCV2等抗體陽性血清對照。應用SPSS21.0數據統計分析軟件對p72-ELISA與p72s-ELISA結果進行kappa一致性檢驗。整個檢測過程嚴格按照生物安全管理制度執行。

1.7.3 p72和p72s蛋白與豬血清特異性抗體反應的Western blot檢測 通過Western blot檢測10份ASFV抗體陽性、2份ASFV抗體陰性豬血清，同時設立CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗體陽性血清對照。根據反應結果，分析p72和p72s蛋白與特異性抗體反應的敏感性。Western blot檢測時，將豬血清作1∶100倍稀釋，于4 ℃孵育過夜；HRP-羊抗豬IgG作1∶4 000稀釋，于室溫孵育2 h；其他步驟同“1.6.1”所述。

2 結 果

2.1 重組質粒的鑒定

分別以構建的重組表達質粒pET-28a-p72和pET-28a-p72s為模板，進行PCR，分別擴增出1 953 bp和1 098 bp的DNA條帶，同時重組質粒經EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切后，分別得到與預期大小一致的核酸片段(圖1)。測序和序列比對分析發現，重組質粒中分別克隆有p72和p72s序列，與預期一致。

A.pET-28a-p72；B.pET-28a-p72s；M.DL10000 DNA相對分子質量標準；1.重組質粒的PCR鑒定；2.重組質粒的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鑒定；3.pET-28a(+)空質粒酶切對照

2.2 重組蛋白的表達及其表達形式

在18～35 ℃下，用0.25 mmol·L-1的IPTG誘導表達4 h，收集菌體，經SDS-PAGE檢測，可見重組質粒pET-28a-p72或pET-28a-p72s轉化菌比空質粒pET-28a轉化菌和大腸桿菌(Rosetta)對照的泳道中分別多出了與預期相符、相對分子質量約76或42 ku的蛋白條帶(圖2)。

A.p72；B.p72s；M.蛋白質相對分子質量標準(Protein Ruler I)；1、2.大腸桿菌；3、4.pET-28a-p72或pET-28a-p72s轉化菌；5、6.pET28a空質粒轉化菌；1、3、5.誘導前；2、4、6.誘導后

通過比較在不同溫度、IPTG誘導濃度和誘導時間下的蛋白表達量，發現當誘導溫度分別為28和26 ℃、IPTG誘導濃度為0.5 mmoL·L-1及誘導時間為5 h時，p72和p72s蛋白的表達量最高。收集誘導表達菌體，超聲波裂解后，在兩個蛋白表達菌體的裂解沉淀中均檢測到預期大小的蛋白條帶，而在上清液中沒有或僅有少量蛋白，表明p72和p72s蛋白主要以包涵體形式表達(圖略)。SDS-PAGE檢測顯示，純化的p72和p72s蛋白條帶清晰，但在全長p72蛋白泳道有一條細小雜帶，而截短蛋白泳道無肉眼可見雜帶(圖3)。

M.蛋白質相對分子質量標準(Protein Ruler I)；1.純化的p72蛋白；2.純化的p72s蛋白

2.3 重組蛋白的Western blot鑒定

重組p72和p72s蛋白與兔抗His標簽多克隆抗體反應后，在相應泳道分別出現一條清晰的與預期大小相符的特異性反應條帶，而相同條件下誘導后的空載體pET-28a轉化菌未見相應大小的條帶(圖4)，表明篩選的攜帶重組質粒的大腸桿菌分別表達了重組p72和p72s蛋白。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.重組p72蛋白；2.重組p72s蛋白；3.pET-28a空載體質粒轉化大腸桿菌誘導產物；箭頭分別指重組p72蛋白和p72s蛋白的免疫印跡

2.4 重組蛋白氨基酸序列及其表位預測

重組p72和p72s蛋白經胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解處理后，LC-MS/MS技術分析發現，表達蛋白的酶解肽段對p72和p72s蛋白推測氨基酸序列的總覆蓋度分別為89.3%和88.39%(圖5)，表明表達蛋白分別為ASFV的全長和截短p72蛋白。抗原表位預測顯示，p72蛋白共含有27個抗原表位，p72s覆蓋其中的63%(17/27)的抗原表位(表2)。

表2 p72和p72s蛋白抗原表位的預測與比較

帶下劃線序列.酶解肽段序列

2.5 重組p72和p72s蛋白免疫小鼠的血清特異性抗體效價

在第3次免疫后9 d，p72蛋白與p72s蛋白免疫小鼠的抗體效價分別為1∶200～1∶25 600和1∶12 800～1∶409 600(圖6)。可見，p72s蛋白刺激小鼠產生的抗體效價高于p72蛋白。

圖6 重組p72(A)或p72s(B)免疫小鼠的血清特異性抗體效價

2.6 基于全長與截短p72蛋白的ELISA具有很好的一致性

分別用基于p72蛋白和p72s蛋白的ELISA檢測9份經倍比稀釋的ASFV抗血清，結果如圖7所示，其中5份血清的抗體效價相同，分別為1∶800(1份)、1∶400(3份)和1∶1 600(1份)；針對另外4份血清，當用p72s蛋白檢測時，抗體效價為1∶400(3份)和1∶200(1份)；p72蛋白檢測時，抗體效價為1∶100(1份)、1∶200(2份)和1∶400(1份)。上述結果顯示基于截短p72蛋白ELISA的敏感性較高。

圖7 基于p72蛋白與截短p72蛋白的ELISA的敏感性比較

p72蛋白或p72s蛋白分別與CSFV、PRRSV、PRV和PCV2等抗血清沒有交叉反應(圖略)。對108份豬血清的檢測結果顯示，p72蛋白和p72s蛋白的抗體陽性檢出率分別為72.2%(78/108)和78.7%(85/108)，抗體陰性檢出率分別為27.8%和21.3%，總符合率為93.5%(101/108)。Kappa檢驗結果顯示，基于p72與p72s蛋白ELISA結果的kappa=0.826(P=0.016)。上述結果表明，基于截短與全長p72蛋白的ELISA結果高度一致，但截短p72蛋白的陽性檢出率較高。

2.7 基于重組p72s蛋白的Western blot的敏感性更高

Western blot檢測結果如圖8所示，10份ASFV抗體陽性血清中有7份與p72蛋白反應，全部與p72s蛋白反應(5號血清為弱陽性)。兩份陰性血清及CSFV、PRRSV、PRV和PCV2等抗血清與p72和p72s均不發生反應。該結果表明，Western blot檢測豬血清特異性ASFV抗體時，p72s蛋白的敏感性更高。

M.蛋白質相對分子質量標準(由高到低依次為100、70、50、40、30和25 ku)；1～10.ASFV抗體陽性豬血清；11～12.ASFV抗體陰性豬血清；13～16.p72蛋白分別與CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗血清的反應；17～20.截短p72蛋白分別與CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗血清的反應

3 討 論

目前，ASFV的檢測技術主要有針對病毒DNA的分子生物學檢測方法和針對病毒的抗原或抗體的免疫學檢測技術兩大類[11]。ASFV檢測方法主要有ELISA和PCR(熒光定量PCR和普通PCR)。p72蛋白在病毒感染晚期表達，該蛋白的表達是ASFV在宿主或細胞內復制的指示器，并且其免疫原性強且穩定，能誘導豬產生高效價的特異性抗體。此外，p72在不同毒株之間高度保守[6,12]，因此，p72蛋白是目前ASF分子生物學和血清學檢測技術研究中最受關注的診斷靶標[13-14]，國內也有關于表達全長或截短p72蛋白的研究報道[15-16]，但尚未見到比較分析全長與截短p72蛋白抗原性的報告，而蛋白的抗原性對于制備多克隆抗體和建立抗體檢測方法至關重要。同時，在試驗過程中，作者發現p72蛋白相對分子質量較大，純化相對困難。故本研究通過比較全長和截短p72蛋白的抗原性，篩選純化方便、抗原性好的檢測抗原，旨在為建立特異性與靈敏度高的抗體檢測方法提供必要實驗材料。

為了獲得容易制備的檢測ASFV-p72特異抗體的蛋白抗原，本研究在初步分析p72蛋白推導氨基酸序列及其抗原表位的基礎上，設計了擴增全長和截短p72蛋白的引物，用于構建重組表達質粒。在設計蛋白表達引物時考慮到截短蛋白應包括p72蛋白的大部分主要抗原表位的基本原則，以保證截短蛋白既方便表達和純化，又具有良好的抗原性。在表達蛋白的提取純化過程中發現全長p72蛋白的雜蛋白含量高于p72s蛋白，即便是純化后，蛋白電泳檢測時，全長蛋白仍然有少量的雜蛋白存在，而截短蛋白則無可見雜蛋白。這表明，截短p72蛋白更方便制備與純化。

據預測，p72蛋白含有27個抗原表位，Heimerman等[17]用桿狀病毒表達系統表達部分p72蛋白(aa 20—303)作為免疫原制備出6株單克隆抗體，分別識別p72蛋白上的4個線性表位：aa 165—171、aa 265—280、aa 280—294和aa 290—303。本研究表達的截短p72蛋白(aa 141—502)包含全長p72蛋白預測表位中的17個表位，同時包含上述單抗識別的4個表位，提示截短與全長p72蛋白一樣，具有良好的抗原性。為了比較全長和截短p72蛋白的抗原性，本研究通過動物免疫、ELISA和Western blot等試驗從免疫原性和反應原性兩方面檢測了兩者的抗原性。動物免疫試驗結果發現，截短p72蛋白能夠誘導小鼠產生更高效價的特異性抗體。基于截短和全長p72蛋白ELISA檢測豬血清ASFV特異性抗體時，兩者的檢測結果高度一致，并且截短p72s蛋白高于全長p72蛋白的抗體陽性檢出率。此結果與截短p72蛋白抗原的檢測敏感性較高有關。隨后，當用Western blot檢測豬血清特異抗體時，也發現截短p72蛋白的抗體檢出率明顯高于全長p72蛋白的檢測結果，尤其當血清抗體水平較低時，全長p72蛋白則無法檢測到相應抗體，但截短p72則可以檢測到。該結果表明，進行Western blot時，截短p72蛋白的反應敏感性更高。此結果的出現可能與截短p72蛋白分子量小，單位體積內抗原性強的抗原表位摩爾分子數多于全長p72蛋白的相應表位分子數有關，對此需要進一步試驗證實。

4 結 論

通過表達全長和截短非洲豬瘟病毒p72蛋白并比較其抗原性，發現截短p72蛋白比p72蛋白具有更好的抗原性，可以用截短p72蛋白作為檢測抗原用于研發ASFV-ELISA抗體檢測方法，當進行Western blot時，截短p72蛋白與特異性抗體反應的敏感性更高。