高脂高糖飲食對小型豬腸道微生物的影響

田威龍，司景磊，劉笑笑，綦文晶，陳奎蓉，程 鋒，李月月，呂冬玲，梁 靚，高九昱，奉玲麗，莫家遠，蘭干球，梁 晶

(廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004)

肥胖已成為當今世界范圍內的健康問題，在發達和發展中國家，肥胖的發生率都在急劇增加[1]。世界衛生組織(2016年)報告稱，18歲及以上的人群中約有39%的個體超重[2]。肥胖是產生其他代謝性疾病的重要危險因素之一，如胰島素抵抗、2型糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化、高血壓和中風等，這引起了公眾的廣泛關注[3-5]。肥胖的發生是一個復雜的過程，涉及遺傳和環境因素(如飲食、食物成分和/或生活方式)，普遍被認為是由能量攝入與消耗之間長期的失衡以及體內脂肪過度增加而引起的[6-7]。目前，越來越多的證據表明，腸道微生物及其細菌基因組(微生物組)會影響營養獲取、能量調節和脂肪存儲[8]。這些發現證明，腸道微生物在調節宿主能量代謝中發揮重要作用，并與肥胖癥和相關代謝疾病的發生有關。

腸道微生物是一個復雜且動態的生態系統，與其宿主共同進化[9]。目前，腸道中的微生物群落被認為是一個“器官”，具有許多影響人類健康的代謝、免疫和內分泌樣作用[10]。腸道微生物群被認為是影響肥胖的重要因素。腸道微生物對宿主肥胖作用的第一個證據來自對無菌(GF)動物的研究，即無細菌且在無菌隔離器中繁殖的動物。1983年，Wostmann等[11]觀察到無菌嚙齒動物需要比傳統的嚙齒動物(擁有自身的微生物群)多30%的熱量來維持體重。肥胖個體和較瘦個體間遠端腸道微生物組的差異提示，肥胖與兩個優勢細菌門，即擬桿菌門和厚壁菌門的相對比例有關[12]。然而，這些研究只是簡單地比較了肥胖和較瘦個體之間腸道微生物的差異，忽略了腸道微生物的動態變化。本研究以廣西巴馬小型豬為動物模型，對其進行高脂高糖飲食干預，采用16S rRNA高通量測序方法，以探究在高脂高糖飲食過程中腸道微生物的動態變化，為研究小型豬生長發育過程中腸道微生物的動態變化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品收集

本研究選擇7頭體重和日齡相近的雌性廣西巴馬小型豬近交系個體，隨機分為普通飲食組(CN組)3頭和高脂高糖飲食組(HFD組)4頭，每頭個體在統一斷奶和保育后轉入育肥舍分別單籠飼養。試驗前，所有個體的飼養環境及飲食條件一致，并且未使用過抗生素。適應飼養1周后，對照組飼喂基礎飼糧，基礎飼糧成分見表1；高脂高糖飼糧配方為：53%基礎飼糧+37%蔗糖+10%油脂，飲食干預為期30 d。在此期間，豬可自由采食和飲水。分別在第0、7、15和30天時收集個體新鮮糞便于1.5 mL無菌凍存管中，立刻放入液氮速凍，后置于-80 ℃ 冰箱保存，待測。在收集新鮮糞便的同時，分別稱量CN組和HFD組個體體重。在試驗結束時測量CN組和HFD組個體的體長和腹圍數據。

表1 CN組基礎飼糧配方及營養成分

1.2 DNA 抽提和測序

根據 E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進行糞便樣品微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量；使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增，擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，27個循環(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s)，然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存(PCR儀：ABI GeneAmp?9700型)。PCR反應體系為：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol·L-1)0.8 μL，下游引物(5 μmol·L-1)0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補足至20 μL。每個樣本3個重復。擴增產物經凝膠電泳檢測后，送上海美吉生物醫藥科技有限責任公司使用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.3 生物信息分析

使用fastp軟件[13]原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件[14]進行拼接；基于默認參數，使用QIIME2流程中的DADA2插件[15]對質控拼接之后的優化序列進行降噪處理。DADA2降噪處理之后的序列通常被稱為ASV(即擴增子序列變體)。基于Sliva 16S rRNA數據庫(v 138)，使用QIIME2中的Naive bayes分類器對ASVs進行物種分類學分析。

2 結 果

2.1 高脂高糖飲食對小型豬體重及體尺的影響

在試驗0、7、15和30 d分別稱量CN組和HFD組個體體重，發現，在試驗開始的0、7和15 d時，CN組與HFD組之間個體體重沒有顯著性差異(P>0.05)；在30 d時，CN組的體重為(37.93±0.58)kg，HFD組的體重為(40.03±0.43)kg，兩組間存在顯著性差異(P≤0.05,圖1)，而動物的體長、腹圍等指標差異不顯著(P>0.05,表2)。

表2 CN組和HFD組豬的30 d體重與體尺情況

**.P<0.05

2.2 樣本16S rRNA測序序列信息

對CN組和HFD組小型豬腸道微生物16S rRNA基因的V3-V4區進行高通量測序，共獲得524 524條有效序列。使用QIIME2流程中的DADA2插件對質控拼接之后的優化序列進行降噪處理，共獲得2 031個ASVs，其中CN組特有486個ASVs，HFD組特有648個ASVs，兩組共有897個ASVs(圖2A)；分為14個門、22個綱、47個目、78個科、191個屬和350個種。基于CN組和HFD組樣品的Sobs指數得到所有樣品的稀釋性曲線(圖2B)。結果顯示，隨著測序量的增加，每個樣品的稀釋性曲線逐漸趨于平緩，說明樣本的測序深度和覆蓋范圍足夠且物種豐富，樣品適合下一步的分析。

圖2 CN組和HFD組ASV水平韋恩圖(A)和Sobs指數曲線(B)

2.3 高脂高糖飲食組與普通飲食組不同時期小型豬腸道微生物Alpha多樣性分析

以細菌物種的多樣性指數(Shannon)和豐富度指數(Chao)作為豬腸道微生物Alpha多樣性的參數(圖3)。發現CN組和HFD組在0、7、15和30 d 4個 不同時期的Shannon指數和Chao指數整體變化趨勢相似，但是HFD組的多樣性指數和豐富度指數在不同時期普遍低于CN組(第15天時除外)。

圖3 CN組和HFD組不同時期豬腸道微生物的Alpha 多樣性

2.4 高脂高糖飲食組與普通飲食組小型豬腸道菌群物種組成及其變化

在門水平上，檢測到CN組和HFD組的優勢門為Firmicutes、Bacteroidetes和Spirochaetota，在兩組間的比例略有差異，且均占據了各組總量的95%以上(圖4A)。隨著試驗的進展，CN組和HFD組在不同時期優勢門的比例發生改變(圖4B)，這可能是由于高脂高糖飲食所導致的。隨即，本研究分析了Firmicutes和Bacteroidetes在高脂高糖飲食飼喂不同時期的變化情況，發現，Firmicutes豐度在HFD組中整體呈現上升趨勢并在30 d時達到最高值(圖4C)，而Bacteroidetes豐度在HFD組中整體呈現下降趨勢并在30 d時達到最低值(圖4D)。

A.物種組成條形圖；B.物種組成和變化Circos圖。CN0、CN7、CN15和CN30分別表示CN組第0、7、15和30天；HH0、HH7、HH15和HH30分表示HFD組第0、7、15天和30天，下同；C.HFD組Firmicutes變化折線圖；D.HFD組Bacteroidetes變化折線圖

在屬水平上，共鑒定到180個屬水平菌(圖5A)，其中CN組和HFD組共有的屬有152個，CN組有17個特有的屬，HFD組有11個特有的屬。CN組和HFD組的優勢菌屬為Clostridium_sensu_stricto_1和Trepponma(圖5B)。HFD組在試驗的不同時期屬水平的微生物組成表現出了動態變化，比如Lactobacillus在HFD組豐度逐漸減少而Ruminococcus豐度則不斷升高(圖5C、D)。

2.5 高脂高糖飲食組與普通飲食組小型豬腸道微生物組成差異

通過PCoA主坐標分析和PCA主成分分析比較CN組和HFD組在7、15和30 d糞便樣品微生物的結構相似性(圖6)。結果發現，CN組和HFD組在7 d時有一部分樣品交叉聚集到一起，隨著飲食干預時間的進展，各組樣品按照飲食和干預時間的區分來越明顯，在30 d時CN組和HFD組能夠明顯區分。以上結果說明，CN組和HFD組不同時期樣本中的微生物組成存在差異。

圖6 飲食干預不同時期ASV水平的PCoA分析(A)和PCA分析(B)

采用LEfSe分析CN組和HFD組之間微生物組成差異性。分支圖顯示了CN組和HFD組在門、綱、目、科、屬分類水平上最豐富的微生物群體(圖7A)。在兩組間共發現20個差異項，其中，12個在CN組中富集，8個在HFD組中富集。LDA分析結果(圖7B)顯示，12個在CN組中富集的菌群分別為g__Lactobacillus、f__Lactobacillaceae、o__Lactobacillales、f__p_251_o5、g__norank_f__p_251_o5、g__norank_f__norank_o__Oscillospirales、f__norank_o__Oscillospirales、g__Lachnospiraceae_UCG_007、f__unclassified_c__Bacilli、g__unclassified_c__Bacilli、o__unclassified_c__Bacilli和p__Verrucomicrobiota，8個在HFD組中富集的菌群分別為f__Lachnospiraceae、o__Lachnospirales、g__Peptococcus、f__Coriobacteriaceae、g__Collinsella、g__Senegalimassilia、g__Lachnospiraceae_AC2044_group和g__Subdoligranulum。

A.LEfSe分析分支圖；B.LDA判別圖

2.6 小型豬腸道微生物組功能預測分析

使用PICRUSt2將ASVs序列與其內部的參考序列比對，確定每個樣本基因家族的豐度；將基因家族信息與KEGG數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)進行比對，獲得KEGG的功能信息和豐度信息(圖8)。結果發現，CN組和HFD組之間腸道微生物基因功能無顯著性差異，均主要富集在氨基酸的生物合成、淀粉與蔗糖的代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝以及糖酵解和糖異生等方面，預測可能富含能夠將相關蛋白分解、轉運和纖維素降解酶的相關基因。

圖8 CN組和HFD組KEGG三級代謝通路熱圖

3 討 論

廣西巴馬小型豬是本研究團隊三代科研人員經過30余年的品系培育獲得的小型豬實驗動物近交品系，具有體型矮小、性成熟早、遺傳相似性和穩定性高、便于實驗操作等優點[16]。此外，豬與人的生理結構、器官大小和飲食結構較為接近，加之廣西巴馬小型豬的單拷貝同源基因比小鼠更加接近于人(除獼猴等靈長類外)，使其更適合作為醫學模型用于人類疾病研究[17]。腸道微生物已經成為近年來的研究熱點，作為一個動態變化的生態系統，受多種因素的影響，其中，飲食被認為是塑造腸道菌群結構的主要驅動力之一[18]。本研究中，巴馬小型豬連續飼喂高糖高脂飼糧1個月，與CN組相比，HFD組動物體重顯著增加，而體長、腹圍等指標差異不顯著，說明高糖高脂飲食導致能量過剩，誘發小型豬朝肥胖方向發展，與相磊等[19]對高糖高脂飼料誘導的小型豬肥胖的研究結果一致。所以，本研究以廣西巴馬小型豬為實驗動物，研究飼喂高脂高糖飲食過程中腸道微生物的動態變化是合理的，突破了以往研究只單純針對某一時間點的局限。

在本研究中，采用16S rRNA基因高通量測序方法分析了由高脂高糖飲食組(HFD組)和普通飲食組(CN組)的糞便微生物組成的動態變化與組間差異。本研究采用目前最新的QIIME2平臺進行分析，使用DADA2插件對質控拼接之后的優化序列進行降噪處理，共獲得了2 031個ASVs。DADA2與傳統的基于OTUs的分析方法不同，其不再以97%序列相似度進行聚類而只是進行去重(相當于以100%相似度聚類)，從而得到“擴增序列變體”ASVs[15]。這大大提高了數據精確度和物種分辨率，比傳統OTUs聚類得到的數據更加理想和準確。

基于微生物16S rRNA基因測序結果，對不同干預時期HFD組和CN組進行多樣性分析。Beta多樣性分析發現，飲食干預7 d時導致微生物組成發生了較小程度的變化，但在第30天時，HFD組相比CN組的變化卻很顯著，這表明高脂高糖飲食可能導致腸道菌群的組成逐步累積改變。而Alpha多樣性分析發現，HFD組腸道微生物的多樣性普遍低于CN組，但兩組間并沒有達到顯著性的差異，表明飲食誘導的腸道微生物群組成的變化可能是由較低水平細菌種類的豐度變化引起的。

隨著高脂高糖飲食干預時間的增加，觀察到了腸道微生物組的總體變化趨勢。在門水平，高脂高糖飲食組個體腸道微生物中，Firmicutes豐度增加而Bacteroidetes豐度逐漸下降。先前的研究已發現，肥胖與厚壁菌門豐度增加和擬桿菌門豐度降低有關[12,20]。在人體相關研究中也得到了類似的結果，Ley等[21]對12名肥胖者進行熱量限制1年，發現在開始減肥飲食之前，肥胖者腸道微生物中的擬桿菌門比例(3%)明顯少于瘦對照組(25%)，厚壁菌門比例相應高于正常體重者，而肥胖者經過減肥后其腸道微生物中擬桿菌門的比例在1年內從3%增加到18%，這是對限制能量攝入的反應。總之，這些在小鼠和人身上得到的結果表明，肥胖改變了腸道微生物的結構，而通過調節腸道微生物的組成可能有助于改善肥胖，這為治療肥胖等疾病提供了新策略。然而，有幾項研究報道稱，肥胖與較瘦受試者的腸道中厚壁菌門(Firmicutes)與擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度比例與以上結果存在差異，甚至發現二者存在相反的關系[22-23]。因此有人提出，這些腸道微生物的組成結構在門水平的變化目前仍不能被認為是肥胖發生的標志物，應該在更低的微生物分類學水平上尋找與肥胖相關的細菌屬甚至特定的細菌種類。

在屬水平上，本研究發現Lactobacillus的豐度在HFD組隨高能飲食誘導逐漸減少而Ruminococcus豐度則不斷升高。乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)是研究最多的益生菌，在實驗動物中進行的多數研究都清楚地表明，服用益生菌可以有效預防和治療肥胖癥。有研究發現，向小鼠單獨或聯合飼喂彎曲乳桿菌HY7601和植物乳桿菌KY1032可限制脂質在脂肪組織和肝中的積累，血漿和肝中的膽固醇含量也顯著降低[24]。在使用副干酪乳桿菌CNCM I-4270和鼠李糖乳桿菌CNCM I-3690飼喂時，獲得了相似的結果[25]。但本研究仍必須謹慎評估從這些研究得出的所有結論，因為在評估益生菌對動物肥胖程度影響的試驗中，經常使用不同類型的日糧喂養不同年齡的動物，而且益生菌的劑量和添加時間也不統一。種種跡象表明，在屬水平上，腸道微生物的組成可能會影響動物從飲食中攝取能量的效率，進而影響肥胖的發生與發展。Ruminococcus是1948年由Sijpesteijn[26]從牛瘤胃中首次分離出來的，是核心腸道微生物組中的主要成員之一。在草食性反芻動物中，Ruminococcus屬微生物可以降解和發酵膳食纖維素，并將其轉化為短鏈脂肪酸(SCFA)，對動物的能量代謝至關重要[27-28]。短鏈脂肪酸不僅可以促進能量吸收及肝中多余的脂肪生成，同時還可以減少炎癥發生，促進腸上皮的屏障完整性和增強動物的飽腹感[29]。Den等[30]報道了短鏈脂肪酸的有益代謝作用，其可以防止高脂飲食(HFD)引起的肥胖并能夠改善胰島素的敏感性。然而，本研究發現，產SCFA的細菌隨著高脂高糖飲食的干預在HFD組逐漸富集。有研究表明，肥胖個體的腸道微生物群富集了參與SCFA生成的代謝途徑，超重和肥胖個體的糞便中短鏈脂肪酸的濃度高于較瘦個體[31]。這些存在差異的結果說明，腸道中SCFA的含量以及腸道微生物的組成結構在肥胖發生過程中的作用方式可能十分復雜。

利用LEfSe分析，也發現了CN組和HFD組之間顯著差異的腸道微生物。其中，g__Lactobacillus、f__p_251_o5和g__unclassified_c__Bacilli等13個菌群在CN組中富集；f__Lachnospiraceae、g__Collinsella、g__Peptococcus、g__Subdoligranulum和g__Senegalimassilia等7個菌群在HFD組中富集。柯林斯菌屬(Collinsella)被認為是2型糖尿病患者中富含的潛在促進炎癥的腸道微生物成分，可導致腸道中的SCFA迅速下降[32]。Liu等[33]認為，Collinsella可作為動脈粥樣硬化患者的生物標記物，與成年蒙古族人心腦血管疾病的高死亡率相關，說明高脂高糖飲食導致腸道中有害微生物的增加。Mach等[34]研究發現，消化球菌屬(Peptococcus)在肥胖豬中含量更高。Kiros等[35]發現，飼喂酵母的斷奶豬生長性能更好，且消化球菌屬豐度更高，表明消化球菌屬對豬的增重有積極作用，這與本研究結果一致。這些微生物可能作為與肥胖發展相關的潛在微生物標志，但還需要進一步的研究來確定潛在微生物標志在肥胖發展中發揮的作用，如利用糞菌移植等方法驗證候選微生物是否能調節無菌動物的體重水平。

總而言之，本研究結果表明，由高脂高糖飲食組(HFD組)和普通飲食組(CN組)的腸道微生物組成與結構在不同干預時期呈現動態的變化和差異，表明特定的細菌物種或物種組合可能直接或間接影響肥胖的發生。這些結果增加了對腸道微生物菌群與宿主的相互作用的認識，并將促進通過綜合因素調控腸道微生物來治療肥胖及其并發癥方法的研究與應用。

4 結 論

本研究采用微生物16S rRNA基因高通量測序方法，對廣西巴馬小型豬高脂高糖飲食組(HFD組)和普通飲食對照組(CN組)的腸道微生物組成的動態變化進行分析。結果發現，在門水平，高脂飲食的干預導致HFD組個體腸道微生物中Firmicutes豐度增加而Bacteroidetes豐度逐漸下降；在屬水平，HFD組中Lactobacillus豐度逐漸減少而Ruminococcus豐度則不斷升高，并篩選了g__Peptococcus、g__Collinsella和g__Senegalimassilia等可能與高能飲食密切相關。本研究為利用小型豬動物模型研究人類高能量飲食對腸道微生物的影響提供一定的理論依據。