母豬妊娠早期血液中差異表達蛋白的鑒定

祁夢凡，謝 蘇，高若男，孫義姍，孫曉梅，和軍飛,2，魯慧文,2，盧世豪，陳 鑫，李清春，黃 濤,2*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.新疆生豬種業工程技術研究中心，昌吉 831100)

在胚胎附植和早期妊娠的相關研究中，由于其涉及的基因、通路和生理過程極其復雜，導致對胚胎附植機制進行解析十分困難。蛋白質是基因表達翻譯的最終產物，直接反映了生物體生命的復雜性和多樣性。蛋白質組學可以對某一時期存在于某一細胞、組織或器官中的所有蛋白質進行組學鑒定和研究。Choe等[1]對患有子宮內膜炎牛的子宮內膜與正常牛的子宮內膜進行蛋白質組學分析，發現desmin和α-actin-2可能在子宮內膜炎的產生中發揮重要作用。Mullen等[2]對胚胎附植前高產奶牛的子宮內環境進行蛋白組研究，總共發現34種差異表達的蛋白質，推測其可能參與了為胚胎附植做準備的子宮環境重構、胚胎生長發育和保護、保持子宮健康、以及母體免疫調節。Koch等[3]鑒定了未妊娠和早期妊娠綿羊子宮液中的蛋白質，發現有15種與胚胎發育相關的差異表達蛋白(最高有65倍)，數據提供了子宮與孕體水平上與妊娠早期相關聯的動態生理過程。通過對蛋白質進行鑒定來研究基因的表達或將成為豬胚胎附植機理研究的一個新思路。

在動物妊娠早期胚胎發育過程中存在的極為復雜的信號傳導網絡[4]中有一些信號分子可以作為妊娠早期分子標志物。1974年在孕鼠血清中發現了早孕因子[5]。早孕因子是最早確認妊娠的生物化學標志物之一，反映胚胎成活能力[6]。HCG是一種糖蛋白激素，受精卵的滋養層細胞在受精后第6天形成,之后就開始分泌微量的HCG，受精后第10天可從母體血清中檢測到，HCG可作為確認妊娠的生物化學標志物[7]，并在人的早期妊娠診斷中得到廣泛應用。薄小輝[8]在奶牛胎兒胎盤中分離鑒定出8種PAGs天然蛋白，并用表達的PAG4重組多肽免疫兔獲得多克隆抗體，可用于區分妊娠奶牛和未妊娠奶牛血清。研究表明，相對于第0天，奶牛人工授精21 d后RSAD2基因的表達量顯著升高[9]。蛋白質在表達調控方面發揮十分重要的作用，它們在動物生長發育不同的生理階段都具有重要的調控作用。iTRAQ技術作為新興的蛋白質組學定量手段，具有重復性好、通量高等優勢，可為蛋白質定量以及尋找相關生物標志物等方面提供可靠依據[10-12]，多被應用于腫瘤生物標志物的篩選[13-14]。通過篩選差異蛋白質來尋找生物標志物的方法已經成為一個主流[15]，但妊娠早期母豬外周血中蛋白標志物的相關研究尚未見報道。

本研究篩選在妊娠早期差異表達的蛋白，驗證了其表達情況，旨在揭示母豬配種后第15天(即胚胎附植期)外周血中蛋白的表達差異，為尋找潛在的母豬早期妊娠生物標志物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1.1.1 測試組 選取8頭健康、生產表現正常且體況相近的長大二元經產母豬作為iTRAQ分析樣本，隨機分為2組，即試驗組和對照組，每組4頭。按照常規生產流程查情配種，試驗組母豬輸入正常的精液，對照組母豬輸入死精(正常精液高溫煮沸，并在顯微鏡下觀察確認精子死亡)。在配種后第15天采集試驗組、對照組母豬血液，分離血漿，立即置于干冰中冷凍保存，并盡快運回實驗室置于超低溫冰箱保存備用。

1.1.2 驗證組 另于大群中隨機采集配種后第15天母豬血液樣本30例作為ROC曲線分析樣本，分離血漿，立即置于干冰中冷凍保存，并盡快運回實驗室并置于超低溫冰箱保存。

1.2 主要試驗儀器

主要儀器包括超低溫冰箱(-80 ℃)、恒溫水浴鍋、高壓滅菌鍋、單道移液器、多道可調移液器、梯度PCR儀、超凈工作臺、NanoDrop 2000(Thermo Scientific，美國)、LightCycler 480實時熒光定量PCR儀、八連排離心機、高速冷凍離心機、電熱恒溫培養箱、水平電泳槽電泳儀、GelDoc X R型凝膠成像系統及酶標儀(Thermo)等。

1.3 主要試驗試劑

主要試劑包括反轉錄試劑盒Primer ScriptTMRT regagent Kit(TaKaRa)、血漿總RNA提取試劑盒(RP4001，百泰克)、Light Cycler 480 SYBR GreenⅠ(Roche)、八連管(Roche)；RNA線性酶(RNR-07250, Epicentre)；DNA MarkerⅠ(天根)、Agarose瓊脂糖(Invitrogen)、ProteoPrep?Blue白蛋白及IgG去除試劑盒(Sigma-Aldrich)、Bradford 蛋白質檢測試劑盒(碧云天)、端粒重復結合因子2(TERF2)、結合珠蛋白(HP)、脂聯素(ADIPOQ)和細絲蛋白C(FLNC)的ELISA試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)等。

1.4 蛋白樣品制備及質檢

從超低溫冰箱(-80 ℃)取出血漿樣品，分別加入4倍體積的裂解緩沖液，進行超聲裂解。然后4 ℃，12 000 g離心10 min，去除細胞碎片，將上清液轉移至新的離心管，利用Bradford 蛋白質檢測試劑盒進行蛋白濃度測定。使用ProteoPrep?Blue白蛋白及IgG去除試劑盒(Sigma-Aldrich)去除高峰度蛋白。SDS-PAGE電泳檢測蛋白樣品質量，以用于后續試驗。

1.5 iTRAQ定量分析

1.5.1 胰蛋白酶酶切、標記、分餾及LC-MS/MS分析 樣品各取100 μg 蛋白加入10 mmol·L-1DTT在37 ℃還原60 min，25 mmol·L-1碘乙酰胺(IAM)暗處室溫反應30 min。使用胰蛋白酶進行二步法酶切，胰酶酶解完成后進行strata x spe 柱子脫鹽，真空干燥。肽段使用8-plex iTRAQ試劑標記。HPLC溶液A溶解干燥的標記后肽段，進行HPLC分餾，收集餾分48管，合成15管。將分餾樣品溶解在溶液 A 中，按表1洗脫梯度進行串聯質譜分析。全掃描分辨率為70 000。離子強度前15位的母離子進行碎裂能為32%的HCD碎裂，動態排除時間為10 s。

表1 洗脫梯度參數

1.5.2 iTRAQ數據分析 通過Uniprot數據庫下載豬蛋白質組數據庫(物種編號：9823，包含40706蛋白質序列，蛋白質組編號：UP000008227)，使用軟件Proteome Discoverer(版本1.3，Thermo Scientific)進行搜庫。設置胰蛋白酶為消化酶，允許2個漏切位點。半胱氨酸碘乙酰化，iTRAQ(肽段N-末端，賴氨酸，酪氨酸)為固定修飾，甲硫氨酸氧化和氨基端乙酰化為可變修飾。搜索設置肽段容差20 ppm，產生的子離子容為0.05 Da，容錯率(FDR)為1%。

1.6 生物信息學分析

利用t檢驗分析兩組樣本間蛋白表達的差異，篩選條件為顯著性檢驗值P<0.05和兩組樣本定量比值FC>1.20或FC<0.83。通過對獲得的差異蛋白GO分析，進行差異表達蛋白的分類注釋。使用KEGG的在線工具KEGG mapper繪制注釋蛋白的代謝通路。利用P值進行蛋白質功能富集，使用R語言中的pheatmap包進行差異表達蛋白的聚類分析。差異蛋白互作網絡分析使用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)在線軟件進行。

1.7 ELISA酶聯免疫吸附測定驗證

參照ELISA試劑盒說明書，檢測FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2蛋白的表達量。使用SPSS 21.0軟件分析妊娠與非妊娠組中差異表達蛋白表達量。數據表示為“平均值±標準誤”，使用t檢驗測試樣品之間的差異。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

1.8 受試者工作特征曲線(ROC)分析

作為ROC曲線分析的配種后15 d母豬外周血液樣本采集后，分別在配種后第25 和第35 天對所有配種母豬進行B超檢驗，以確定是否妊娠。參照ELISA試劑盒說明書，檢測配種后15 d母豬外周血液中FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2蛋白的表達量，并進行受試者工作特征曲線(ROC)分析。

2 結 果

2.1 去高豐度蛋白及 SDS-PAGE電泳

經SDS-PAGE凝膠電泳分析，凝膠圖結果顯示(圖1)，從血漿中獲得了含量相對豐富的蛋白質，條帶清晰，無拖尾現象，相對于血漿原液，蛋白樣品已去除大量高峰度蛋白且無降解，滿足后續蛋白質組學檢測要求?？偟鞍子肂radford蛋白濃度測定試劑盒分析檢測發現濃度均超過7.0 μg·μL-1，能夠滿足后續上機的iTRAQ試驗要求。

A01、A03、A06、A12為妊娠第15天血液蛋白樣本；A02、A04、A09、A10為非妊娠第15天血液蛋白樣本

2.2 差異表達蛋白篩選

利用t檢驗分析兩組樣本間蛋白表達的差異，篩選條件為顯著性檢驗值P<0.05和兩組樣本定量比值FC>1.20或FC<0.83。共檢測到917個蛋白，差異表達蛋白24個，圖2為差異蛋白聚類圖。妊娠與非妊娠相比，上調蛋白19個，下調蛋白5個(圖3)。與非妊娠組相比，妊娠組中有許多蛋白表達上調，包括雌激素受體2(ESR2)、肌動蛋白(MSC)、端粒重復結合因子2(TERF2)、結合珠蛋白(HP)、纖溶酶原(PLG)、脂聯素(ADIPOQ)，以及下調的絲氨酸/蘇氨酸激酶31(STK31)。表2列出了全部24個差異表達蛋白。

表2 妊娠與非妊娠組中24個差異表達蛋白

列代表不同樣品，行代表不同的蛋白質ID，以表達量的log2值進行聚類，紅色表示高表達蛋白質，綠色表示低表達蛋白質

試驗組(妊娠)與對照組(非妊娠)相比，上調蛋白19個，下調蛋白5個

2.3 差異表達蛋白GO富集分析

參考豬蛋白質數據庫和Gene Ontology(GO)數據庫注解的蛋白質功能，進行差異蛋白的功能分類(表3)。GO注釋顯示，差異蛋白主要涉及了線粒體DNA代謝、端粒維持、細胞通訊、細胞生長、補體激活及天然免疫應答、細胞骨架和雌激素激活等生物學功能，這些功能與早期胚胎發育及胚胎附植存在緊密聯系。

表3 與動物繁殖及胚胎發育相關的GO功能類別

2.4 差異表達蛋白KEGG富集分析

差異蛋白KEGG富集分析結果顯示，共富集到43條KEGG通路，從中篩選了16條可能與動物繁殖及胚胎發育相關的通路列于表4，對差異表達蛋白KEGG注釋結果進行分類。KEGG分析顯示，差異蛋白所涉及的通路主要包括PI3K-Akt、p53、MAPK、Estrogen和mTOR等多條信號通路，這些細胞信號通路在胚胎附植期中具有關鍵作用。結果還顯示了差異蛋白參與了造血細胞譜系和同種異體移植排斥兩條信號通路。

表4 與動物繁殖及胚胎發育相關的信號通路

2.5 差異表達蛋白ELISA驗證分析

為進一步驗證iTRAQ檢測的蛋白表達結果，本研究使用ELISA技術對以上4個蛋白的表達情況進行驗證。結果表明4個蛋白在兩組中的表達情況與iTRAQ檢測結果一致，該結果驗證了iTRAQ結果的可信度(圖4)。

肩標小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)

2.6 差異蛋白網絡互作分析

蛋白質之間的相互作用構成了細胞生化反應網絡的主要組成部分，蛋白互作網絡對細胞及其信號的調控有重要意義。利用NCBI數據庫查找差異蛋白中與早期胚胎發育、胚胎附植等生物學現象或信號通路有關的蛋白，最終選出了FLNC、ADIPOQ、HP及TERF2等4個蛋白利用STRING數據庫繪制蛋白互作網絡圖(圖5)。

圖5 胚胎附植相關的蛋白互作網絡圖

在PPI網絡中，節點表示單個蛋白，線表示它們之間的關系。結果表明，同一個蛋白可能參與了許多不同生理過程，如MAPK通路、PI3K-Akt通路、雌激素激活等。除了APOE、F2、APOA1等節點外，PPI網絡中HP、FLNC等蛋白也為主要樞紐蛋白。提示我們鑒定到的差異蛋白可能與早期胚胎附植存在緊密的聯系并可能通過參與這些信號通路來影響豬早期胚胎植入，進而影響豬的繁殖。

2.7 受試者工作特征曲線(ROC)分析

驗證組樣本經去除豬場自淘母豬及不合格樣品且經2次B超復檢診斷妊娠后，最終可以使用的樣品數量為配種后15 d母豬21頭，其中妊娠17頭，未妊娠4頭，剔除9頭。采用以上全部合格樣品豬的血液進行后續試驗。根據ELISA試驗結果，分別進行ROC曲線分析，并計算其AUC面積及置信度(圖6)，將差異蛋白作為生物標志物將預測結果分析(表5)。結果顯示，FLNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP的AUC面積分別為0.882、0.985、0.941、1.000、1.000、1.000，且均有較高的顯著性；在真陽性率方面(妊娠母豬診斷為妊娠狀態)也均有較高的準確性，分別為88.2%、94.1%、82.4%、100%、100%和100%。

表5 差異蛋白作為生物標志物預測結果分析

A.FLNC的ROC分析曲線；B.ADIPOQ的ROC分析曲線；C.HP的ROC分析曲線；D.TERF2的ROC分析曲線；E.FLNC-ADIPOQ的ROC分析曲線；F.ADIPOQ-HP的ROC分析曲線

3 討 論

在生物體內，某些特定蛋白的豐度變化往往預示著該生物體相關結構和功能的轉變。在蛋白質組學研究中，系統識別和蛋白質的定量顯得尤為重要[16]。iTRAQ技術是新興的蛋白質組學定量技術，在蛋白質的種類、數量和結果的可靠性及可重復性上具有優勢。它特別適用于篩查血清或血漿中的生化標記[17-18]。本研究對配種后第15天妊娠與非妊娠組母豬外周血液中蛋白質的差異表達情況展開了研究，共鑒定到蛋白917個，其中24個差異表達蛋白，上調蛋白19個，下調蛋白5個。通過GO注釋和KEGG分析，進一步篩選了4個與胚胎附植相關的差異蛋白——FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2，經ELISA驗證和ROC曲線分析，其可作為母豬早期妊娠診斷的潛在生物標志物。

在人類子宮內膜基質[19]和蛻膜[20]中發現了HP的表達和定位，表明其可能在著床期起作用，這可能與靈長類動物胚胎的深層間質植入有關。HP在母豬發情周期不同階段的輸卵管和子宮中存在，豬輸卵管和子宮中HP蛋白的mRNA的表達在發情周期黃體晚期最為豐富，表明它在生殖過程中起重要作用。研究發現，在體外胚胎生產過程中加入結合珠蛋白可提高囊胚率[21]。妊娠第12天子宮內膜蛋白豐度研究中，HP表達量增加了10倍。這種妊娠引起的HP增加可能是由于其免疫調節和血管生成的特性[22]。此外，在包括人類、牛和狗在內的一些物種中，HP在維持、配子結合、受精和妊娠期間母體-胎兒免疫耐受的生殖過程中起著基礎作用[20,23-24]。在植入期子宮內膜中，HP蛋白mRNA特異性表達，而在發情期或假孕第4天子宮內膜中則無表達[24-25]。

女性在月經周期的分泌中期觀察到較高的AdipoR1和AdipoR2基因表達，這表明胚胎植入準備過程中子宮內膜的變化可能有脂聯素的參與。體外試驗證明，ADIPOQ可以提高豬胚胎發育到囊胚的成功率[26]。AdipoR1和AdipoR2在人[27]和豬[28]子宮內膜中的存在及其在月經周期分泌中期的表達水平升高，首次證明ADIPOQ可能在胚胎植入中起關鍵作用。

還有研究指出，反復胚胎種植失敗小鼠內膜脂聯素受體表達顯著下調，推測脂聯素異常調節對胚胎著床產生影響[29]。ADIPOQ能促進子宮蛻膜組織中 FOXO3 蛋白表達，進而推測其影響子宮蛻膜化過程，維持妊娠早期免疫耐受[30-31]。Salker等[32]研究發現，通過抑制PI3K/Akt可以誘導子宮內膜細胞中SGK1活性增強，破壞胚胎間距和早期的胎盤-蛻膜相互作用，阻止胚胎著床。同源性磷酸酶張力蛋白(PTEN)是目前發現的PI3K/Akt中最主要的負性調節因子，PI3K/Akt的激活受體內PTEN的影響，其異常升高會抑制PI3K/Akt活性并使下游的MMP-9表達下調，使子宮內膜受滋養層細胞的侵襲力不夠，影響早期胚胎發育及著床[33-34]。

本研究在妊娠母豬早期血液中檢測到的相關差異蛋白表達量的變化趨勢，與前人在其他物種妊娠早期子宮內膜等組織中的研究存在相似性，這也證實了本研究的可靠性。

目前，豬妊娠早期生物標志物的研究較少。Shen等[35]發現，妊娠母豬血液中差異表達mRNA(LPAR3、RXFP4、GALP、CBR1、CBR2、GPX6、USP18、LHB和NR5A1)參與母豬早期妊娠調控，并可能作為母豬早期妊娠診斷的分子標記物。本研究中的ROC曲線分析結果表明，FLNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP的真陽性率(妊娠母豬診斷為妊娠狀態)均有較高的準確性，分別為88.2%、94.1%、82.4%、100%、100%和100%；ADIPOQ、HP及TERF2的假陽性率(未妊娠母豬診斷為妊娠狀態)為0，FLNC為25%。真陰性率(未妊娠母豬診斷為未妊娠狀態)ADIPOQ、HP及TERF2均達到100%，FLNC為75%。而假陰性率(妊娠母豬診斷為未妊娠狀態)TERF2為0，ADIPOQ為5.9%，FLNC為11.8%，HP為17.6%。FLNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP在診斷母豬妊娠狀態的準確率分別為85.71%、95.24%、85.71%、100%、100%和100%。這表明，配種后15 d妊娠與未妊娠母豬外周血液中差異蛋白FLNC、ADIPOQ、HP及TERF2適合作為豬早期妊娠診斷的潛在生物標志物。

4 結 論

本研究利用iTRAQ技術篩選配種后15 d妊娠與非妊娠母豬外周血液中的蛋白，發現24個蛋白存在差異表達(P<0.05)，其中存在4個與胚胎附植相關的差異表達蛋白(FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2)。ROC曲線分析結果也進一步表明，配種后15 d母豬外周血液中的差異表達蛋白FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2可作為母豬早期妊娠的潛在生物標志物，為母豬胚胎附植機制研究提供了新的思路。