MEI1基因可變剪切事件對蒙古馬精子生成的調控作用

崔迎迎，芒 來*，李 蓓*，特日格樂，趙一萍，任秀娟，宋連杰，蘇少鋒,3

(1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區馬屬動物遺傳育種與繁殖學重點實驗室，呼和浩特 010018；2.承德市農林科學院，承德 067000；3.內蒙古自治區農牧業科學院，呼和浩特 010031)

可變剪切又叫選擇性剪切(alternative splicing, AS)，普遍存在于真核生物體內，是一種保守的生物學過程，指主要基因或者mRNA前體轉錄所產生的RNA的外顯子以多種方式通過RNA剪切進行重連，由此產生的不同mRNA可能被翻譯成不同的蛋白質構體。隨著RNA-Seq測序技術的廣泛應用，在人類基因組中發現參與編碼蛋白質的基因大約有21 000個，約95%的基因可以發生可變剪切，且不同的可變剪切事件的調控方式也具有差異性[1-3]。因此，可變剪切對真核生物的生長繁殖、信號傳導等生物學現象的研究有重要意義。

基因篩選中發現，控制哺乳動物減數分裂同源重組過程的關鍵基因主要有SPO11、MSH4、MSH5、RAD51、DMC1、MLH1和EXO1等[4]，其中MEI1基因首次在胚胎干細胞化學誘變產生的不育小鼠體內篩選分離，也是在哺乳動物中發現的第一個通過正向遺傳學方法確定的減數分裂特異性突變型基因，被初步描述為顯示雄性減數分裂缺陷的突變體。研究發現，MEI1被定位在人類的22號染色體和小鼠的15號染色體上，分別在睪丸組織和性腺中高表達[5]。MEI1基因發生突變不僅可以引起復發性葡萄胎，其雙等位基因突變也與早期胚胎阻滯和復發性著床失敗有關[6]；另外，Mathilde等[7]也發現，MEI1缺陷卵母細胞能夠受精并啟動胚胎發育過程，但大多數在2～4細胞期停止發育。在減數分裂過程中，重組是由蛋白SPO11誘導的雙鏈斷裂(DSBs)形成而開始的，研究發現MEI1是一個包含BRCA1 C端結構域的蛋白，特異性調控減數分裂細胞周期，并在一些不依賴于SPO11 DSBs重組修復的DNA修復事件中發揮關鍵作用，是脊椎動物精子發生過程中減數分裂前期DNA DSBs形成所必需的[8-9]。綜上，MEI1基因參與調控精子生成和卵母細胞減數分裂過程。

睪丸作為雄性動物的重要生殖器官，有產生精子和雄性生殖激素的作用。睪丸細胞包括間質細胞、支持細胞(SC)和生殖細胞，且均對精子發生起調控作用[10]。其中SC附著在曲細精管基膜上，包圍著不同生長階段的生精細胞，內含發達的內質網、線粒體、核糖體和高爾基體等，有利于合成、運輸多種促進生精細胞發生所必需的營養因子并參與構成血睪屏障(blood-testis barrier, BTB)[11-14]。研究發現，SC能促進精索形成，為生物體青春期精子發生過程中的細胞生理和代謝提供支持，保證生殖細胞分化、減數分裂和向精子轉化過程的正常發生[15-16]。SC還通過活躍的自噬行為調節雄激素結合蛋白(ABP)代謝，為生精細胞提供高濃度雄激素環境[14]。此外，睪丸SC作為精原干細胞(SSCs)生態位和BTB結構的主要貢獻者，在精原細胞生態位和BTB破壞和恢復的過程中發揮著核心作用，保證雄性生物體功能性睪丸的正常發育[17]。SC上還存在多種與精子發生相關的因子及其受體，例如：雄性激素(MH)、促卵泡激素(FSH)、膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、纖溶酶原激因子(PA)等，并促進幾種生物活性肽生成，促進支持精子發生和生殖細胞之間的聯系，從而支持生殖能力，參與調控精子發生過程[18-25]。

本課題組在前期轉錄組測序研究中發現，性成熟后的蒙古馬睪丸組織中，發生可變剪切ES事件的MEI1基因在性成熟后的睪丸組織中表達量較高，且差異顯著，說明MEI1基因的可變剪切方式可能與精子生成有關。因此，本試驗以MEI1為目的基因，以未發生ES事件的MEI1-1為對照組，以發生ES事件的MEI1-2為試驗組，設計構建MEI1-1-pIRES2-EGFP和MEI1-2-pIRES2-Dsred兩種質粒并轉染至蒙古馬SC，CCK-8檢測轉染細胞的增殖及活力情況，qRT-PCR檢測減數分裂相關基因在兩類細胞中的差異表達情況。探索MEI1發生ES可變剪切事件對蒙古馬精子生成的調控作用，實現利用分子調控技術提高馬的精子數量和精液品質，有效提高繁殖效率，降低生產成本，加快遺傳進展，促進種群繁衍。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗對象 研究所需的支持細胞(SC)來源于兩歲蒙古馬的睪丸，細胞的分離及體外培養嚴格參照本實驗室的操作進行[26]。

1.1.2 主要儀器、試劑 生物超凈臺(ESCO)、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)、超低溫冰箱-80 ℃(Haier)、高壓滅菌鍋(YAMATO)、恒溫水浴鍋(YiTong)、電子天平(OHAUS)、磁力攪拌器(LIA)、純水儀(OLABO)、瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技)、臺式離心機(常州潤華電器)、細胞培養皿(Corning)；凝膠成像儀、CFX實時熒光定量PCR儀、普通PCR反應擴增儀均購自Bio-Rad；酶標儀、CO2恒溫培養箱均購自Thermo；不同規格的移液槍、高速冷凍離心機均購自Eppendorf。

Insulin、谷氨酰胺、DMEM/F12、NaHCO3、DMSO、G418均購自Sigma；DPBS、FBS、0.25% Trypsin-EDTA(1×)均購自Gibco；LipofectamineTM3000、PureLinkTM HiPure Plasmid Maxiprep Kit、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits均購自Thermo；miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)、CCK-8細胞活力檢測試劑盒(biosharp)、TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus,TaKaRa)。

1.2 試驗方法

1.2.1MEI1發生和未發生可變剪切事件載體的構建 命名未發生ES事件的MEI1基因為MEI1-1，發生ES事件的MEI1基因為MEI1-2。

1.2.1.1 MEI1-1-pIRES2-EGFP載體的構建：從NCBI數據庫中獲取已公布的家馬(equuscaballus)MEI1基因序列(XM_023631220)，用Primer 5.0軟件進行引物設計。在空載體pIRES2-EGFP上插入長度為3 840 bp的MEI1序列，克隆位點為Xhol(CTCGAG)-Smal(CCCGGG)，測序并繪制重組質粒圖譜。

1.2.1.2 MEI1-2-pIRES2-Dsred載體的構建：Premier 5.0軟件進行引物設計(引物信息見表1)。分別用MEI1-2-Xhol-F/MEI1-2up-R，MEI1-2 down-F/MEI1-2-Smal-R為引物，以MEI1基因合成的MEI1-1為模板擴增2個片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物并將2個片段產物回收純化備用。Overlapping PCR擴增MEI1-2基因，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的產物進行Xhol、Smal雙酶切，并構建到同樣酶切的pIRES2-Dsred 載體上，進行測序，繪制重組質粒圖譜。

1.2.2 兩種質粒轉染蒙古馬支持細胞 質粒大提后酶標儀檢測質粒的濃度及純度，分裝并于-20 ℃保存備用。實驗室前期研究發現，第三代的蒙古馬睪丸SC活性最高，因此復蘇第二代SC，傳代至大皿獲得活性及長勢較好的第三代蒙古馬SC，待細胞長至70%～90%匯合度時用LipofectamineTM3000將兩種質粒轉染于SC。在37 ℃，5% CO2的細胞培養箱培養6 h后換液，并在轉染24、48、72 h時在熒光顯微鏡下記錄轉染情況。用CCK-8試劑盒分析轉染細胞的活力及增殖，分析比較同一轉染時間點兩種質粒轉染細胞的差異性。

1.2.3 CCK-8檢測轉染細胞的增殖及活性 96孔板中體外培養第三代蒙古馬SC，待長至70%～90%細胞匯合度時轉染兩種質粒。分別再轉染0、24、48、72 h時(每個時間點設置6個平行)加入100 μL新的完全培養液和10 μL CCK-8溶液(盡量不要在孔中生成氣泡)并于恒溫培養箱中孵育1～4 h，酶標儀測定在450 nm處的吸光度，檢測轉染細胞的增殖及活性情況。

1.2.4 G418篩選轉染細胞 構建的兩種載體均帶有新霉素篩選標記(G418)，便于提高轉染效率，增加后續試驗的準確性。預試驗確定G418最佳篩選濃度，以便后續試驗的連續性。在轉染效率最高、細胞活性最好時添加最佳篩選濃度的G418篩選轉染細胞，每3 d換液，待細胞長至90%時收集細胞，用于后續試驗。

1.2.5 提取轉染細胞的總RNA并反轉錄成cDNA 經G418篩選的轉染細胞長至90%匯合度時進行胰酶消化、1 500 r·min-1離心5 min、小心棄上清收集細胞，標注轉染質粒的名稱；miRNeasy Mini Kit試劑盒提取細胞總RNA；酶標儀檢測RNA濃度及純度，并迅速將RNA反轉錄成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.2.6 qRT-PCR 檢測減數分裂相關基因在細胞中的差異表達情況 以轉染MEI1-1-pIRES2-EGFP的SC細胞為對照組，轉染MEI1-2-pIRES2-Dsred的SC細胞為試驗組，GAPDH作為內參基因進行校正，檢測減數分裂通路部分驗證基因及支持細胞信號通路在精子發生減數分裂調節中的部分因子在兩種細胞中的表達量。Primer premier5.0進行引物設計(表2)，并由上海生工生物工程有限公司合成。

反應體系：TB Green 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free ddH2O 3.2 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 20 s，共30個循環；60 ℃退火7 min；4 ℃保存。反應結束后整理Ct值，采用單因素方差分析法進行數據分析。

2 結 果

2.1 第三代蒙古馬SC培養

復蘇實驗室凍存的第二代蒙古馬SC，經一次傳代繼續培養，在光學顯微鏡下觀察如圖1所示，細胞增殖速度快、長勢較好、形態一致且未有老化的現象，符合后續細胞轉染試驗的要求。

圖1 培養第3天的第3代蒙古馬SC

2.2 載體構建

2.2.1 MEI1-1-pIRES-EGFP載體構建結果與分析 將合成的MEI1-1基因通過Xhol(CTCGAG)和Smal(CCCGGG)克隆位點構建到pIRES2-EGFP空載體上。瓊脂糖凝膠電泳檢測構建結果如圖2所示，目的條帶與目的基因片段的長度相一致，證明MEI1-1-pIRES2-EGFP質粒構建成功。繪制MEI1-1-pIRES2-EGFP重組質粒質譜圖見圖3，MEI1-1基因通過Xhol和Smal克隆位點插入帶有綠色熒光蛋白并具有卡那抗性的pIRES2-EGFP空載體中，質粒全長9 099 bp，其中插入的MEI1-1基因3 840 bp。該載體同時具有新霉素(G418)篩選標記，便于提高轉染效率和后續qRT-PCR的準確性。

1.質粒；2.Xho l-Sma l酶切質粒；M.DNA相對分子質量標準

圖3 MEI1-1-pIRES2-EGFP 質粒圖譜

2.2.2 MEI1-2-pIRES2-Dsred載體構建結果與分析 分別以MEI1-2-Xho l-F/MEI1-2-up-R和MEI1-2-down-F/MEI1-2-Smal-R為引物，以MEI1-1為模板擴增2個片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物(圖4)。純化擴增產物并用Overlapping PCR技術擴增MEI1-2基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物(圖5)，將產物2純化回收，經雙酶切構建到同樣酶切的空載體上。經測序構建重組質粒圖譜(圖6)，質粒全長8 951 bp，帶有紅色熒光蛋白并具有卡那抗性和新霉素篩選標記，便于后續轉染試驗的觀察分析和篩選，提高轉染效率，減少qRT-PCR的誤差，保證試驗的準確性。

Up.以MEI1-2-Xho l-F/MEI1-2-up-R為引物擴增的產物；down.以MEI1-2-down-F/MEI1-2-Sma l-R 為引物擴增的產物

M.DNA相對分子質量標準；1、2.分別為不同融合的1個PCR產物

圖6 MEI1-2-pIRES2-Dsred質粒圖譜

2.3 兩種質粒轉染蒙古馬SC

構建的兩種質粒分別在轉染SC 24、48、72 h時觀察轉染效率。比較發現，兩種質粒均在轉染48 h時轉染效率最高(圖7、圖8)。

A.暗場像；B.明場像

A.暗場像；B.明場像

2.4 CCK-8檢測轉染細胞的增殖及活性

根據檢測數據用XLSX工作表作圖(圖9)顯示，轉染兩種質粒的細胞在轉染0～72 h之間細胞增殖及活力狀況呈“S”形趨勢，均先下降再上升再下降，其中在轉染0～24 h曲線下降，但轉染MEI1-1-pIRES-EGFP質粒的細胞活性高于轉染MEI1-2-pIRES2-Dsred質粒的細胞；在轉染24～72 h曲線先上升后下降，且轉染MEI1-2-pIRES2-Dsred質粒細胞的活性較轉染MEI1-1-pIRES-EGFP質粒的細胞的活性增長速度快，并在48 h時兩種質粒轉染的細胞活性最高，可用于轉染后細胞的篩選。

圖9 CCK-8檢測轉染細胞的增殖及活性折線圖

2.5 G418篩選轉染細胞

細胞轉染48 h時添加預試驗摸索的G418最佳篩選濃度(350 μg·mL-1)，每3 d更換一次新的完全培養液直至細胞長至90%匯合度時熒光顯微鏡拍照觀察(圖10、圖11)篩選結果并收集細胞。由圖可知，經G418篩選的兩種質粒轉染的細胞，轉染效率均明顯提高，有利于減小后續qRT-PCR的誤差。

A.暗場像；B.明場像

A.暗場像；B.明場像

2.6 qRT-PCR檢測

利用熒光信號積累實時監測整個qRT-PCR過程，以F=2-ΔΔCt為運算公式并用SPSS進行單因素方差分析(ANOVA)，并用Graphpad作圖。如圖12所示，目的基因在兩種細胞內表達量均差異顯著，且在MEI1-2-pIRES2-Dsred轉染的SC細胞內表達量均高于MEI1-1-pIRES2-EGFP轉染SC細胞的表達量。證明發生ES事件的MEI1在SC中的表達量高于未發生ES事件的MEI1表達量，且經SC更有利于調控減數分裂和精子發生過程，影響精子生成。

A、B、C.減數分裂通路部分驗證基因檢測結果；D.支持細胞信號通路中調節精子發生減數分裂的部分因子檢測結果

3 討 論

隨著測序技術的廣泛應用，越來越多的研究表明正常的可變剪切事件可以豐富基因組和蛋白質組的多樣性、調控生物體的生長發育過程，異常的可變剪切事件可能會引發生物體疾病[27]。有研究發現，SALL4可變剪切體調控損傷會導致心和腎發育缺陷，還可能會引起中國女性卵巢發育不成熟[28]；WT1突變體缺陷(-KTS)會影響生殖嵴細胞的增殖，增加性腺前部區域的凋亡細胞數量，影響原始生殖細胞的增殖[29-30]；特異性敲除生殖細胞中Ranbp9后會導致精母細胞和精細胞大量缺失[31]；Rbm5缺失會導致大量功能性基因的pre-mRNA剪接發生異常，影響雄性動物生育功能[32]；特異性敲除雄性生殖細胞中的PTBP2會造成精母細胞的大量凋亡和精細胞分化的停滯，并且伴隨生殖細胞mRNA的可變剪接嚴重異常，影響雄性生殖細胞的存活等[33]。由此可見，可變剪接以其獨特的調控方式廣泛參與精子生成過程，為雄性生殖細胞的健康發育提供了堅實基礎。

MEI1是已發現的正常減數分裂染色體突觸中的必需基因，并可能參與生殖細胞減數分裂DSBs的形成過程。我們在前期轉錄組測序研究中發現，發生可變剪切ES事件的MEI1基因在性成熟后的睪丸組織中表達量較高，且差異顯著，說明MEI1基因的可變剪切方式可能與精子生成有關。而睪丸SC作為唯一一種可以直接接觸不同發育階段的生精細胞的體細胞，不僅參與形成BTB，為精子發生提供穩定的微環境，還分泌多種營養因子促進精子的發生。因此，本試驗以蒙古馬SC為目的細胞，探索MEI1發生和不發生ES事件對精子生成的影響。結果表明，在細胞增殖檢測結果中，轉染發生可變剪切事件的MEI1過表達載體的SC生長情況明顯優于轉染未發生可變剪切的SC。說明MEI1基因可變剪切確實有效促進了支持細胞生長，從而促進成熟精子生成。

減數分裂發生期間非同源染色體自由組合、同源染色體非姐妹染色單體間部分片段發生交叉互換(基因重組)增加了基因變異種類和配子的遺傳多樣性，有利于物種適應不斷發生變化的環境，保證物種的延續[34]。為了研究睪丸SC細胞與精子發生過程的關系，選取部分減數分裂通路上的關鍵基因，檢測其在兩類細胞中的差異表達情況。其中，PPP2R5C突變會影響細胞增殖、加速細胞凋亡速度并可能導致正常細胞轉化為惡性細胞[35-36]；下調SKP1會提高早期胚胎染色體結構或數目變異幾率，促進胚胎早期發育的同時增加了早期胚胎的死亡率[37]；CUL1與SKP1共同介導蛋白質降解過程，調控細胞周期和早期胚胎發育過程[38-39]；敲除雄性小鼠睪丸中的CCNB1和CCNB2后，精原細胞不能正常增殖，凋亡增加，導致不育[40-42]等。結果顯示，目的基因表達量均在發生可變剪切的細胞上較高，且差異顯著。說明MEI1基因的可變剪切確實上調了減數分裂相關基因的表達，從而影響精子生成活動。

睪丸支持細胞不僅為生精細胞的發生提供多種營養因子，并參與構成有利于精子發生的一種微環境，保護支持生精細胞的增殖和發育。為了研究發生ES事件的MEI1基因通過睪丸SC調控精子生成過程，選取支持細胞信號通路上與精子發生減數分裂調節中的部分因子檢測其在兩類細胞中的差異表達情況。其中，FSH可以提高動物的排卵數和繁殖率，當其作用于睪丸曲細精管時則可以提高精子的形成能力[43]；GDNF受FSH和睪酮的調控作用促進睪丸SC的增殖和BTB的形成[20,44]；ARID家族參與調控細胞增殖發育過程，主要與基因表達及染色質重塑有關[45]；Stra8基因是啟動減數分裂的重要基因，是保證精子發生過程正常進行的決定性因素[46]等。結果顯示，目的基因均在發生可變剪切的細胞上表達較活躍，且差異顯著。說明MEI1基因的可變剪切促進了支持細胞的活性，并最終促進精子生成。

4 結 論

本研究通過對MEI1-1-pIRES2-EGFP和MEI1-2-pIRES2-Dsred載體的構建，利用CCK-8試劑盒、實時熒光定量PCR等技術檢測轉染蒙古馬睪丸支持細胞后SC的增殖及基因的表達情況，證實MEI1發生可變剪切事件有助于細胞的生長和增殖，與減數分裂相關的基因在轉染后兩類細胞中的表達量差異顯著，且均在轉染MEI1-2-pIRES2-Dsred的SC內表達量較高，證明發生ES事件的MEI1基因更有利于促進減數分裂和精子發生過程。本試驗可為進一步的蒙古馬育種工作提供依據，更加全面、深入探索基因可變剪切事件對精子生成的調控作用。