豬CD163基因的單堿基編輯研究

趙為民，王慧利，曹少先，郭日紅，王澤平，陳 哲，徐 奎，付言峰，李碧俠，任守文，程金花*

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所 江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，南京 210014；2.農業農村部種養結合重點實驗室，南京 210014；3.江蘇省農業科學院宿遷農科所，宿遷 223800；4.中國農業科學院深圳農業基因組研究所，深圳 518124)

CRISPR/Cas9系統是細菌為抵御病毒入侵所進化的一種適應性免疫系統[1-3]。該系統利用gRNA識別并引導核酸酶Cas9對靶DNA進行切割，誘發DNA的非同源重組(NHEJ)或同源重組(HDR)損傷修復機制，從而實現對靶基因序列的編輯[4-6]。CRISPR/Cas9系統自開發以來已被廣泛用于疾病治療、基因功能研究與新品種培育[7-11]。

CRISPR/Cas9系統誘導DNA雙鏈斷裂后，細胞內傾向于利用非同源重組方式修復[12]，這種修復方式隨機性強，插入或刪除的堿基數難以控制,有時無法對目的基因產生敲除效果，從而導致篩選有效的突變體耗時耗力。單堿基編輯技術(base editor)是基于CRISPR系統的新型靶基因定點修飾技術，在不產生DNA雙鏈斷裂的情況下，利用胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶對靶位點進行精準的單堿基編輯，實現C-T或A-G的替換，從而開發了CBE和ABE系統[12-13]，自2016年報道以來受到了廣泛的關注。CRISPR/Cas9系統在制備動物疾病模型和治療單堿基遺傳疾病的潛力成為了研究熱點。然而后續許多研究表明，胞嘧啶單堿基編輯器存在嚴重的DNA脫靶[14-15]，胞嘧啶單堿基編輯器和腺嘌呤單堿基編輯器還存在著大量的RNA脫靶效應[16-17]，使單堿基編輯工具的安全性受到了質疑，限制了單堿基編輯系統在動植物中的精準和多樣化突變的應用。Zuo等[18]通過突變APOBEC1上的ssDNA結構域相應氨基酸，得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體YE1-BE3-FNLS工具。優化后的YE1-BE3-FNLS在保證高保真的情況下，顯著提高了基因編輯效率，從而成為既安全又高效的新單堿基基因編輯工具。Doman等[19]也報道了YE1-CBE系統在保持較高編輯效率的同時降低了DNA和RNA上的脫靶。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)俗稱藍耳病，是一種世界性傳染病，也是嚴重危害我國生豬產業的高度烈性傳染病，給養豬業造成巨大的經濟損失[20]。研究表明，CD163基因是藍耳病毒侵入細胞的重要受體[21-24]，通過敲除CD163基因或功能域能有效的抵御藍耳病毒的感染[25-29]。

本研究通過YE1-BE3-FNLS系統對豬CD163基因進行單堿基編輯，通過C>T，在其第七外顯子將其中一個密碼子CAA改變為終止密碼子TAA，可實現該基因翻譯的提前終止，為后續制備安全有效的CD163基因敲除豬提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株與質粒

PX330載體由農業農村部種養結合重點實驗室保存；YE1-BE3-FNLS載體由中國農業科學院深圳農業基因組研究所左二偉研究員贈予。

1.2 主要試劑

MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit、mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit、MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit、TCM-199和EGF購于Thermo fisher公司；REPLI-g single cell kit購于Qiagen公司；化學試劑購于Sigma公司。DNA marker、DNA聚合酶PrimerSTAR Max Premix、購于TaKaRa公司；DNA純化回收試劑盒購于Zymo Research公司；引物合成與測序驗證由北京擎科公司完成。

1.3 CD163基因的sgRNA設計

使用在線軟件(http://chopchop.cbu.uib.no/)設計CD163基因(XM_021091120.1)的sgRNA靶標位點[30]。首先考慮Efficiency>50%的sgRNA，然后是Off-targets指標，選取的sgRNA序列位點盡量沒有Off-targets所述的0、1、2、3錯配類型；綜合Self-complementarity和GC含量篩選CD163基因的候選sgRNA序列。在候選sgRNA的基礎上，進一步采取以下規則：由于YE1-BE3-FNLS載體的單堿基編輯窗口較短(C5-C6)，因此設計的sgRNA的第5或第6位堿基為C，并且C5或C6后續的兩個堿基為GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA與起始密碼子ATG之間的堿基數為3的整數倍。

1.4 CD163基因的sgRNA與YE1-BE3-FNLS載體的擴增與體外轉錄

以PX330載體為模板，在設計的CD163-sgRNA的正向引物引入T7 promoter引物(加粗堿基)和sgRNA序列(下劃線堿基)，正向引物序列F:TAATACGACTCACTATAGGGAGTACAACATGG-AGACACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG，反向引物R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC。以YE1-BE3-FNLS載體為模板，擴增APOBEC-Cas9n-UGI，正向引物F: TAATACGACTCACTATAGGGGATCC;反向引物R: TCGAGGCTGATCAGCGGGTTTTTA。PCR擴增體系：mix 10 μL，F引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O補至20 μL；擴增條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，33個循環；72 ℃延伸1 min。

對CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段進行回收純化，進行體外轉錄。CD163-sgRNA利用MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit進行體外轉錄，方法參考試劑盒說明書。APOBEC-Cas9n-UGI片段利用mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit進行體外轉錄，方法參考試劑盒說明書。轉錄后的RNA純化參考MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit。對體外轉錄純化后的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI mRNA進行混合，使兩者終濃度分別為50 和100 ng·μL-1。

1.5 卵母細胞體外成熟培養

屠宰場收集豬卵巢后3 h內運回實驗室，生理鹽水充分洗滌后，注射器抽取3～6 mm卵泡，體視鏡下挑選卵丘致密、胞質均勻的卵丘細胞-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。將挑選的COCs置于卵母細胞體外成熟液中(TCM-199培養基含10% porcine follicular fluid, 0.1% PVA, 3.05 mmol·L-1D-glucose, 0.91 mmol·L-1sodium pyruvate,0.5 IU·mL-1FSH,0.5 IU·mL-1LH, 10 ng·mL-1EGF和0.57 mmol·L-1cysteine)，在38.5 ℃，5% CO2，飽和濕度的培養箱中培養44～48 h，培養結束后將COCs轉移到0.1%透明質酸酶中脫去卵丘細胞，挑選排出第一極體、質膜完整的MII期卵母細胞備用。

1.6 卵母細胞孤雌激活與體外注射

將上述MII期卵母細胞用激活液(0.3 mol·L-1mannitol, 0.05 mmol·L-1CaCl2, 0.1 mmol·L-1MgSO4, 0.1% BSA)充分洗滌后，置于注滿激活液的電融合槽內，利用ECM2001融合儀施加1.2 kv·cm-1，40 us的直流電脈沖進行孤雌激活，經PZM3胚胎培養液充分洗滌后，放入含5 μg·mL-1CB的PZM3培養液中繼續培養3 h，再經充分洗滌并轉入石蠟油覆蓋的PZM3中于38.5 ℃, 5% CO2，飽和濕度的培養箱中培養10～12 h后，利用Nikon NT88-V3顯微注射系統進行顯微注射。

1.7 單堿基編輯驗證與off-target分析

利用REPLI-g single cell kit提取擴增單個胚胎的基因組DNA。在酒精燈上拉細毛細管后吸取單個胚胎置于0.2 mL離心管，加入PBS和D2 buffer，65 ℃裂解10 min，加入stop buffer，最后加入預混的master mix，30 ℃ 8 h，65 ℃3 min。結束后用TE buffer稀釋10倍。對單堿基編輯區域進行PCR擴增，引物為F: TCTGGTGTGCCTTTGACTCC; R: CCAGTGAGAGTTGCAGAGGG,預期擴增產物大小為865 bp。PCR擴增體系：mix 10 μL，F引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O補至20 μL；擴增條件：94 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，33個循環；72 ℃延伸1 min。PCR產物擴增后進行回收純化，送北京擎科公司進行sanger測序。off-target分析所用引物見表1。

表1 Off-target分析所用引物

2 結 果

2.1 CD163基因的sgRNA序列的設計與篩選

CD163基因位于5號染色體的正義鏈，有17個外顯子。網站結果顯示共有423個sgRNA針對CD163基因的外顯子。在綜合分析Efficiency(>50%)、Off-targets指標(MM0、MM1、MM2值為0)、Self-complementarity(0)和GC含量(40%～60%)后發現，候選CD163-sgRNA共有49個。由于YE1-BE3-FNLS載體的單堿基編輯窗口較短(C5-C6)，因此對候選sgRNA的第5或第6位堿基要求為C，并且C5或C6后續的兩個堿基為GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA與起始密碼子ATG之間的堿基數為3的整數倍。考慮到盡量在基因的前中部進行單堿基編輯，綜合這些因素最終篩選的CD163-sgRNA序列為：AGTACAACATGGAGACACGT，PAM為GGG。此sgRNA的第5位堿基為C，其后續兩個堿基為AA，位于CD163基因的第7外顯子(num1479，圖1)。并且在CD163的mRNA序列中，CD163-sgRNA序列中的CAA與起始密碼子ATG之間堿基數為1 479，為3的整數倍。當發生C>T突變時，密碼子發生了CAA>TAA突變，形成終止密碼子，可使CD163基因在第7外顯子處提前終止翻譯。CD163-sgRNA的特征如表2所示，符合預期要求。

表2 CD163-sgRNA序列特征

圖1 CD163-sgRNA序列的位置示意圖

2.2 CD163基因的sgRNA與APOBEC-Cas9(D10A)-UGI片段的體外擴增

如圖2顯示，分別以PX330和YE1-BE3-NLS載體為模板，PCR擴增的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI片段大小與預期相符合。

A: M.DNA相對分子質量標準；1.CD163-sgRNA擴增產物；B: M.DNA相對分子質量標準；1.APOBEC-Cas9n-UGI擴增產物

2.3 豬孤雌胚胎的顯微注射

利用顯微操作儀對激活的豬孤雌胚胎進行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA的顯微注射，每個胚胎注射10～20 pL后繼續培養。圖3為注射后2～4細胞期的豬孤雌胚胎。

圖3 豬孤雌胚胎注射RNA混合物的2～4細胞期

2.4 單堿基編輯的效果驗證

挑選單個發育至桑椹胚或囊胚的胚胎，利用單細胞全基因組擴增試劑盒REPLI-g single cell kit對胚胎進行基因組DNA的提取與擴增。經過8 h擴增后，單個胚胎的DNA濃度為1.7～1.8 μg·μL-1，滿足后續PCR擴增要求。分別對對照組和注射組的胚胎DNA進行編輯區域的PCR擴增，產物測序的序列分析發現對照組的預期位點為C(圖4A)，注射組的20個胚胎中有8個胚胎的DNA在預期位點(num 1479)出現C>T突變(圖4B)。而進一步分析發現有額外4個胚胎的DNA在預期位點中雖然序列顯示為C，但峰圖結果顯示該位點出現C與T堿基的雜峰，表明該位點被成功編輯(圖4C-D)。綜合分析在挑選的20個胚胎中有12個的DNA在預期位點出現C>T突變，單堿基編輯效率約60%。

2.5 CD163-sgRNA的off-target分析

由于選取的CD163-sgRNA在錯配3個堿基的情況下能匹配到豬基因組的5個位置，利用Cas-OFFinder對這5個錯配的位置進行序列分析。表3顯示了這5個off-target的基因組位置，4個位于1號染色體，1個位于4號染色體，這5個off-target在基因組中相應的錯配位點分別用小寫字母表示，如表3的第3列。Off-target1在C9、C11、C15三個位點有錯配；Off-target2在C13、C14、C18三個位點有錯配；Off-target3在 C4、C14、C19三個位點有錯配；Off-target4在C3、C11、C18三個位點有錯配；Off-target5在C2、C13、C14三個位點有錯配。這5個off-target區域在C5位點都是C，因此對這5個off-target區域進行PCR擴增，測序結果的峰圖顯示選取的CD163-sgRNA在這5個off-target位置上的C5位點并沒有發生C>T單堿基編輯(圖5)。

圖5 對照組(A)與注射組(B)CD163-sgRNA的off-target位點測序分析

表3 CD163-sgRNA的off-target位點

3 討 論

豬是最重要的家畜動物之一，在農業生產和生物醫藥中具有重要的應用價值。單核苷酸多態性(SNPs)是豬品種和個體間遺傳變異的一種主要類型，對性狀的形成起著重要作用[31]，對重要的功能性SNP位點進行預期突變可加速豬的育種進程，然而CRISPR/Cas9系統誘發的同源重組的損傷修復存在效率低以及細胞內傾向于非同源重組修復[12]，因此很難實現高效穩定的單堿基突變。單堿基編輯器作為新一代基因編輯工具，可為豬的精準遺傳改良提供一種可行的解決方案。

YE1-BE3-FNLS作為新一代的高精度、高活性的單堿基編輯工具，可顯著降低脫靶效應和提高編輯效率[18]，具有廣闊的應用前景。但是該工具的編輯窗口較短C5-C6，而且胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1對GC motif中胞嘧啶的編輯效率不高[32]，因此在設計sgRNA的時候需要進行大量的篩選，如果是利用sgRNA創造終止密碼子，很有可能篩選不到好的sgRNA。本研究中針對CD163初篩了49個參數較好的候選sgRNA，但是最終確定的CD163-sgRNA只有1個，因此與傳統的CRISPR/Cas9系統相比，單堿基編輯工具sgRNA的篩選與鑒定要顯得更為繁瑣。

由于sgRNA本身較短，長度在20 bp左右，因此在基因組上容易匹配到多個位置，從而造成脫靶效應[33]。本研究選取的sgRNA序列位點的off-targets所述的0、1、2、3錯配類型為(0,0,0,5)，而0、1、2、3分別代表在基因組上錯配0～3個堿基數量的sgRNA個數，本研究中的CD163-sgRNA在錯配0、1和2個堿基情況下沒有off-target，而在錯配3個堿基下的5個off-target位點都沒有發生堿基突變，因此表明該CD163-sgRNA在基因組上高度特異。

研究表明，CD163基因不僅可作為PRRSV的受體，還參與清除血漿中的血紅蛋白等生物過程[34]。因此，CD163基因功能的喪失可能存在未知的風險。然而有研究表明與野生型相比，CD163基因敲除豬在經濟性狀(例如產肉與繁殖性狀以及免疫性狀例如巨噬細胞作為血紅蛋白-結合珠蛋白清除劑)的表型都沒有發生顯著變化[27,35]，因而CD163敲除豬的安全性還需要進一步持續研究。

目前，已有多個團隊利用CRISPR/Cas9技術制備了CD163 敲除豬，其方式是通過CRISPR/Cas9介導的同源重組(HDR)或DNA片段刪除[25-26]，這兩種方式的效率較低，而且對于DNA片段刪除需要借助2條sgRNA，額外增加了可能的脫靶性。而且DNA片段刪除的方式也容易額外插入堿基序列，不易獲得純合的CD163敲除豬[26]。

姚旭東等[36]利用單堿基編輯系統對羊MSTN基因進行了精準編輯，表明單堿基編輯系統具有較好的特異性。本研究中的單堿基編輯效率較高，達到了60%，而且造成的堿基突變類型單一，容易得到純合突變，為后續精準制備CD163基因敲除豬提供了技術支撐。

4 結 論

本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上對豬的CD163基因進行了單堿基編輯，成功使得該基因第7外顯子預期位點(num1479)C突變為T，從而使得密碼子CAA突變為TAA，可提前終止CD163基因的翻譯。