糖尿病視網(wǎng)膜病變患者CD4+CD25+Foxp3+Treg與VCAM-1、ICAM-1的變化及意義*

孫 娜，何明海，楊文翔，李雪璐

(1.四川省南充市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室,四川南充 637000)

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(international diabetes federation,IDF)的數(shù)據(jù)顯示，2014年全世界有 3.87億糖尿病患者。預(yù)計(jì)至2035 年，糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到6億[1-3]。我國(guó)是全球糖尿病患者人數(shù)最多的國(guó)家，據(jù)2013年IDF統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，我國(guó)20～79歲糖尿病患者為0.98億，預(yù)計(jì)至2035年將增至1.43億[4-5]。國(guó)內(nèi)的1項(xiàng)研究報(bào)道了2007年6月至2008年5月的大樣本抽樣調(diào)查結(jié)果，我國(guó)糖尿病及糖尿病前期患者人數(shù)分別為0.92億和1.48億；而2010年的流行病學(xué)調(diào)查顯示分別增至1.14億和4.93億，由此可見(jiàn)我國(guó)面臨著巨大的糖尿病預(yù)防和治療壓力[6]。視網(wǎng)膜病變是糖尿病患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)病因素與高血糖對(duì)血管壁的損傷及免疫因素密切相關(guān)，而免疫因素在近年來(lái)越來(lái)越被研究者們認(rèn)可，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg)在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過(guò)程中扮演著重要的角色，有研究報(bào)道稱(chēng)CD4+CD25+Foxp3+Treg有助于減少牛奶蛋白過(guò)敏的發(fā)生，并幫助誘導(dǎo)免疫耐受[7]。而CD4+CD25+Foxp3+Treg的改變會(huì)影響機(jī)體的炎性反應(yīng)，改變細(xì)胞血管黏附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)[8]。亦有研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)[9]。但其參與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚無(wú)研究報(bào)道，本研究擬收集并分析糖尿病視網(wǎng)膜病變患者CD4+CD25+Foxp3+Treg與VCAM-1、ICAM-1的變化并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集并分析四川省南充市中心醫(yī)院2017年10月至2019年5月收治的112例糖尿病視網(wǎng)膜病變患者設(shè)為觀察組，其中男65例，女47例；平均年齡(44.56±10.05)歲；病程2～7年，平均(3.92±1.13)年。同期選擇糖尿病而無(wú)視網(wǎng)膜病變患者112例設(shè)為對(duì)照組，其中男58例，女54例；平均年齡(45.08±11.21)歲；病程1～7年，平均病程(3.68±0.91)年。觀察組和對(duì)照組患者平時(shí)血壓控制良好，無(wú)高血脂、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等心血管并發(fā)癥。2組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有糖尿病患者均符合WHO推薦的2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)觀察組患者的糖尿病視網(wǎng)膜病變分期為Ⅳ～Ⅵ期；(3)所有患者及家屬均知情同意，簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)1型糖尿病及繼發(fā)性糖尿病患者；(2)近期使用(口服或靜脈注射)免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素者；(3)眼部具有疾病史者；(4)近期具有感染史者；(5)具有腫瘤等消耗性疾病者。選取2017年10月至2019年5月門(mén)診體檢的112例健康志愿者設(shè)為空白組，其中男62例，女50例，平均年齡(45.69±12.36)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂及其他慢性病史，近期無(wú)感染史及眼部疾病史。本研究得到了南充市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本的采集與分離

使用真空抗凝采血管采集所有研究對(duì)象的晨起靜脈血約5 mL×3管，PBS洗滌后制成單核細(xì)胞懸液。另取單核細(xì)胞懸液150 μL，向其中分別加入15 μL FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體(RM-4，貨號(hào)：45-0042-82，美國(guó)eBioscience公司)與PE標(biāo)記的CD25單克隆抗體(PC61.5，貨號(hào)：17-0251-82，美國(guó)eBioscience公司)，避光后室溫放置0.5 h，之后加入2 mL 事先預(yù)冷的 PBS，離心機(jī)1 000 r/min震蕩洗滌5 min，隨后加入1 mL的破膜劑(貨號(hào)：A24261，美國(guó)eBioscience公司)，1 h后加入透膜緩沖液(規(guī)格：00-19001，美國(guó)eBioscience公司)，10 min后離心重懸，緊接著加入10 μL PE-Cy5標(biāo)記的Foxp3抗體(PCH101，貨號(hào)：35-4776-41，美國(guó)eBioscience公司)，避光后室溫放置0.5 h，之后加入2 mL 事先預(yù)冷的PBS，離心機(jī)1 000 r/min震蕩洗滌5 min，然后加入500 μL的PBS重懸。

1.2.2空腹血糖(FBG)及糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測(cè)

取清晨空腹外周靜脈血5 mL，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清FBG水平，試劑盒購(gòu)自浙江藍(lán)森生物科技有限公司；采用高效液相離子層析分析儀(美國(guó)安捷倫科技公司)檢測(cè)HbA1c水平。

1.2.3全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)水平

取清晨空腹外周靜脈血5 mL，3 500 r/min(離心半徑7.5 cm)離心20 min，取上清液，血清CRP水平采用7600-020型全自動(dòng)生化儀(日本日立公司產(chǎn)品)測(cè)定。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg

采用Coulter Epics XL 流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)對(duì)各組懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。在FSC-SSC點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群選項(xiàng)，分析CD4+CD25+T細(xì)胞內(nèi) Foxp3的表達(dá)情況。根據(jù)同型對(duì)照中的陰性細(xì)胞確定Foxp3空白和陽(yáng)性閾值，以此陽(yáng)性閾值求得測(cè)定管的Foxp3在CD4+CD25+T細(xì)胞的陽(yáng)性率。

1.2.5ELISA法檢測(cè)VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)水平

采用ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清VCAM-1(批號(hào)：ab47355，英國(guó)Abcam公司)和ICAM-1(批號(hào)：ab174445，英國(guó)Abcam公司)的表達(dá)水平。所有的操作流程均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求嚴(yán)格執(zhí)行。具體步驟如下：室溫下從密封袋中取出實(shí)驗(yàn)所需板條，事先預(yù)留空白孔，分別將標(biāo)本血清和不同濃度的試劑標(biāo)準(zhǔn)品置于相應(yīng)孔中(100微升/孔)，密封板孔后置于烤箱37 ℃反應(yīng)60 min。密封避光保存，洗板機(jī)洗板3次,每次15 min，加入TMB顯色工作液(包括空白孔)每孔100 μL，置于37 ℃保溫箱避光孵育，待各板孔出現(xiàn)梯度顏色時(shí)即可加入終止液，每孔100 μL，根據(jù)樣品吸光度(A)值計(jì)算樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組患者的一般資料比較

3組患者年齡、腰臂比(WHR)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組及對(duì)照組BMI、FPG和HbA1c水平與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而觀察組與對(duì)照組BMI、FPG和HbA1c水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組患者的一般資料比較

2.2 3組患者血清細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

3組患者IgE水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組和對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+Treg陽(yáng)性率均低于空白組，CRP水平均高于空白組，且觀察組CD4+CD25+Foxp3+Treg陽(yáng)性率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組CRP水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 3組VCAM-1和ICAM-1表達(dá)水平比較

觀察組和對(duì)照組患者VCAM-1和ICAM-1表達(dá)水平均高于空白組，且觀察組VCAM-1和ICAM-1表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 3組患者血清細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

表3 3組VCAM-1和ICAM-1表達(dá)水平比較

3 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病常見(jiàn)的十分嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致視力喪失的主要原因[10-12]。糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病代謝紊亂和內(nèi)分泌系統(tǒng)與血液系統(tǒng)損害在視網(wǎng)膜上的綜合反映，其發(fā)病率隨糖尿病病程的發(fā)展而增高，40歲以上糖尿病患者，大約有40%存在視網(wǎng)膜病變，大約8.2%存在視力損傷[13-14]。而在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，許多患者在發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病時(shí)，已經(jīng)錯(cuò)失了預(yù)防性治療的最佳時(shí)機(jī)，因此及時(shí)準(zhǔn)確地給予治療，對(duì)于挽救患者視力，提高其生活質(zhì)量具有極其重要的意義。

CD4+CD25+Treg是1995年SAKAGUCHI等[15]發(fā)現(xiàn)的對(duì)免疫反應(yīng)有重要調(diào)控功能的T 細(xì)胞亞群，通過(guò)主動(dòng)調(diào)節(jié)的方式抑制存在于正常機(jī)體內(nèi)潛在的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與增殖，并識(shí)別自身抗原肽和分泌抑制因子；而CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)多種表面分子，其中Foxp3+是目前公認(rèn)的CD4+CD25+Foxp3+Treg的特異性標(biāo)志物[16-18]。本研究結(jié)果顯示，觀察組和對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+Treg陽(yáng)性率均低于空白組，CRP水平均高于空白組，且觀察組CD4+CD25+Foxp3+Treg陽(yáng)性率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg明顯低于糖尿病無(wú)視網(wǎng)膜病變患者。原因可能是患者CD4+CD25+Foxp3+Treg減少?gòu)亩鴵p傷視網(wǎng)膜，與既往報(bào)道較為一致[18]。

VCAM-1是一類(lèi)與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)的黏附分子。在許多疾病病理過(guò)程中，VCAM-1有利于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到局部組織，炎癥反過(guò)來(lái)又促進(jìn)組織新生血管生成化[19- 20]。本研究結(jié)果顯示觀察組和對(duì)照組患者VCAM-1和ICAM-1均高于空白組，且觀察組VCAM-1和ICAM-1水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果說(shuō)明VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)在糖尿病患者血清中表達(dá)水平較高，而在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中表達(dá)水平更高，與本研究預(yù)期相符，臨床上在糖尿病治療的過(guò)程中應(yīng)給與重視，定期檢測(cè)血清CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量及VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)水平，為明確病因和患者的早期診療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但其具體的機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與CD4+CD25+Foxp3+Treg及VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)密切相關(guān)，臨床醫(yī)生可根據(jù)這些指標(biāo)給予糖尿病患者針對(duì)性治療。