干細胞源性細胞外囊泡在牙周再生治療中的研究進展*

張秀麗，武 曦 綜述， 李昀生 審校

(1.北京聯合大學門診部口腔科,北京 100101;2.陸軍軍醫大學第二附屬醫院口腔科,重慶 400037;3.應急總醫院口腔科,北京 100028)

牙周炎是1種慢性感染性疾病，是由于菌斑生物膜導致機體產生免疫應答，進而導致牙齒支持組織的破壞，最終造成牙齒的松動和脫落，是牙喪失的重要原因[1]。再生性治療是牙周炎治療的重要手段之一，其目的是重建因牙周炎破壞的牙周組織的解剖結構及功能，包括牙槽骨、牙周膜及牙骨質[2]。然而，牙周組織的再生一直被認為極富挑戰性，其中干細胞由于具有多向分化及自我復制的能力，被認為是1種有效的再生治療手段，具有廣泛的臨床前景[3]。 細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細胞分泌的具有雙層膜結構的脂質囊泡，干細胞分泌的EVs可表現出與干細胞相近的功能，如促進組織修復及再生等[4]。利用干細胞源性EVs治療可以規避干細胞移植的風險，提供無細胞再生的方法，近年來成為再生領域的研究熱點之一[5]。本文對干細胞源性EVs在牙周再生中的研究進展及應用作一綜述。

1 EVs的生物學特性

1.1 EVs的生物起源

根據EVs的生物發生機制及生物生理學特性，EVs可分為3類：外泌體(exosomes)、微囊泡(microvesicles)及凋亡小體(apoptotic bodies)。外泌體的直徑大小為30～120 nm，其形成是通過細胞膜內吞，與早期內體(early endosomes)融合，內陷形成多囊泡體(multivesicular bodies,MVBs)。MVBs與細胞膜上特定的部位融合，形成芽泡，以外泌的方式釋放[6]。在細胞膜內吞融合過程中，細胞質中的成分會通過內體分選復合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)分選到MVBs內的管腔內囊泡(intrlunimal vesicles,ILVs)中[7]。

與外泌體不同，微囊泡是1組直接源于細胞膜的非凋亡細胞外囊泡，直徑大小為50～1 000 nm。當細胞激活信號引起細胞質的Ca2+水平增高，導致脂質運載蛋白的變化，翻轉酶的失活及轉出酶的活化，細胞膜出泡，形成微囊泡，釋放到細胞外[8]。

細胞在凋亡過程中會釋放一類細胞外囊泡，稱為凋亡小體。凋亡小體的直徑范圍較大，在50～2 000 nm，其形成是細胞膜向外出泡，并包含部分細胞膜片段[9]。

1.2 EVs的組成

EVs的組成成分會根據細胞來源有所不同，總體而言，EVs普遍包含蛋白質、脂質和核酸等多種生物活性物質[10]。EVs的蛋白成分主要包括質膜蛋白及與其形成相關的蛋白，如ESCRT和膜運轉相關蛋白。外泌體含較多跨膜蛋白及多泡小體形成相關蛋白，而微囊泡富含整合蛋白、選擇蛋白及CD40配體[11]。EVs中包含大量核酸，包括DNA、微RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、轉運RNA及長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)，可以表現出不同的生物學功能。EVs脂質成分包括鞘磷脂、膽固醇、磷脂酰絲氨酸及神經酰胺，存在于其脂質雙分子層膜中，而EVs內部也包含膽固醇、類花生酸脂肪酸等生物活性脂質[12]。

1.3 干細胞源性EVs的生物學功能

干細胞源性EVs可通過旁分泌途徑發揮干細胞的治療作用[4]，包括：(1)組織損傷中起到保護作用；(2)免疫調節作用；(3)促進血管形成、細胞分化及抑制細胞凋亡的作用。干細胞源性EVs在幾種損傷類型的疾病中顯示出了可期望的治療前景。RANGHINO等[13]在急性腎損傷的大鼠模型研究中發現，干細胞源性EVs可以通過激活腎小管上皮細胞增殖而減輕腎損傷及改善腎功能。在急性肝損傷動物模型研究中，TAN等[14]發現干細胞源性外泌體可以引起增殖蛋白的高表達并抑制肝細胞凋亡，從而起到細胞保護作用。干細胞源性EVs亦可緩解動物模型的心肌損傷。MAO等[15]研究發現，EVs中的miRNA224-5p可以起到對抗心肌細胞凋亡的作用。干細胞源性EVs具有免疫活性，包含趨化分子及細胞因子可以調控免疫細胞。這些細胞因子包括轉化生長因子-β(TGF-β)、干細胞生長因子(HGF)、吲哚胺-2，3-雙加氧酶-1(IDO-1)及白細胞介素-10等，可以通過信號通路調控自然殺傷細胞(NK細胞)，單核細胞、T細胞、B細胞及樹突狀細胞[16]。干細胞源性EVs還有促進血管生成的功能。有研究發現，在支氣管肺發育不良的大鼠模型中，干細胞源性EVs可以對Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺血管內皮細胞起到保護作用，從而改善模型動物的肺泡化及血管生成[17]。

2 干細胞源性EVs在牙周再生中的應用

2.1 干細胞源性EVs治療的優勢

在當前的牙周再生性手術中，往往采用合成或天然的生物材料用以修復牙周支持組織的結構及功能，但這些治療手段尚不能獲得可靠而完全的牙周再生。因此，干細胞源性EVs基于組織工程學及干細胞的再生療法作為新療法逐漸嶄露頭角[18]。干細胞由于具備自我更新、多向分化及免疫調節的功能，被許多學者應用于牙周再生的研究中。在動物實驗中，自體或異體的干細胞增殖后，附于各種支架材料上，移植于動物的牙周缺損組織中，可以成功地重建出牙槽骨樣、牙骨質樣及牙周韌帶樣組織[19]。然而，直接的干細胞療法卻存在許多問題。首先，移植的干細胞進入體內后，會大量死亡，最終發揮細胞替代再生作用的數目有限。其次，體內干細胞移植治療也存在致瘤風險，細胞生長及分化不可控，以及可能的免疫原性[20]。有研究顯示，干細胞源性EVs的介質可以復制干細胞的治療效果，提示在干細胞介導的組織再生中，旁分泌因子起到重要作用[21]。干細胞源性EVs還具備其他的諸多優勢。首先，干細胞源性EVs不表達細胞表面組織相容性復合體(MHC)，因此，免疫原性更低；其次，與干細胞需要培養、難于貯存不同，EVs易于存儲，可長期保存并保持活性[22]。綜合這些優點，干細胞源性EVs凸顯了巨大的治療潛力，為組織再生提供了無細胞治療的全新前景。

2.2 干細胞源性EVs在牙周再生中的應用

牙周炎的臨床特征就是牙周支持組織的破壞，其中包括牙槽骨、牙周膜、牙骨質及牙齦，因此，牙周組織再生包括牙槽骨、牙周膜和牙骨質的再生。干細胞源性EVs在牙周再生方面的研究主要集中于體外實驗和動物實驗。

在人骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)分泌的EVs與牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PLSCs)共同培養的研究中，結果顯示BMMSCs分泌的外泌體可以促進PLSCs的體外增殖和成骨分化能力[23]。ZHANG等[24]的研究中將人間充質干細胞來源的EVs與BMMSCs共同培養，發現EVs為BMMSCs所吸收，隨之BMMSCs發生增殖和成骨分化。當介質中加入磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抑制劑時，成骨過程受到抑制。說明EVs誘導的BMMSCs增殖和成骨分化部分是通過PI3K/AKt通路所激活的。而牙周再生的主要目的之一就是因牙周炎破壞的牙槽骨的再生。GANGADARAN等[25]研究發現，在體外，人脂肪干細胞來源的EVs可以增強血管內皮細胞的遷移和增殖，而且可以促進血管內皮細胞的管狀形成，而在小鼠體內實驗中，EVs可以促進血管形成，而血管形成是牙周組織再生所必須的生理學基礎。

干細胞源性EVs在牙周再生的體內研究多選擇不同干細胞來源的EVs或包含EVs的條件培養液(conditioned medium，CM)，應用各種給藥方式在動物模型上進行研究。MOHAMMED等[26]采用結扎建立大鼠牙周炎模型，將脂肪干細胞來源的EVs注射到缺損區，結果獲得排列有序的類似牙周膜韌帶的組織再生，治療效果優于采用脂肪干細胞本身的治療效果。CHEW等[27]用膠原海綿作為人干細胞源性EVs的載體，用于外科所致大鼠牙周骨內缺損的再生治療，結果發現含有新生骨及牙周韌帶的牙周組織再生。該研究發現，EVs是通過CD73介導的腺苷受體激活蛋白激酶B及細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路來促進牙周膜細胞的遷移及增殖。QIU等[28]用手術造成大鼠的牙周組織缺損，用可吸收膠原膜作為載體，結合牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)、牙齦間充質干細胞(gingival mesenchymal stem cells,GMSCs)來源的EVs進行治療，結果獲得明顯的牙周組織再生。其機制可能包括PDLSCs、GMSCs來源EVs對牙炎癥因子的調控及促進成骨前體細胞的成骨分化。另一研究選擇牙周炎大鼠模型，用水溶膠作為載體，將BMMSCs源性EVs注入牙周病變區。結果顯示BMMSCs源性EVs可以促進牙周組織的再生，其部分原因可能為EVs介導OPG/RANKL/RANK信號通路以調節破骨細胞功能，以及影響巨噬細胞聚集和TGF-β1 表達來調節炎癥免疫反應[29]。類似的實驗研究也發現，脂多糖預處理過的牙囊細胞來源的EVs可以促進牙周膜細胞的增殖，并且將載有牙囊細胞來源的EVs的水溶膠注射到牙周炎大鼠模型的牙周袋中，可以促進牙周組織的再生[30]。

綜上所述，無論干細胞的選擇還是載體的選擇，動物模型研究發現，干細胞源性EVs可以為牙周組織再生提供有效的更為安全的新無細胞療法。但EVs應用于牙周再生目前尚無人體研究，真正應用于臨床實踐，尚需進一步的基礎及設計良好的臨床試驗加以驗證。