魚腥草素鈉聯合亞胺培南西司他丁鈉對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌體外抑菌作用的研究*

周孟杰，毛建梅， 蔡 燕

(川北醫學院附屬醫院：1.檢驗科；2.產前診斷中心；3.風濕免疫研究所，四川南充 637000)

鮑曼不動桿菌是醫院感染中重要的多重耐藥細菌之一，其感染死亡率可達35%[1]。2019年全國細菌耐藥監測數據顯示，鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達55.5%和57.1%，并呈現多重耐藥[2]，致使臨床能選擇的抗菌藥物越來越少。魚腥草具有抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等均具有抑菌作用[3]，復方魚腥草能抑制鮑曼不動桿菌生長[4]。本研究以魚腥草揮發油中的活性成分癸酰乙醛亞硫酸鈉加成物(即魚腥草素鈉)為研究對象[3]，對魚腥草素鈉聯合亞胺培南西司他丁鈉對碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌(carbapenem resistant acinetobacter baumannii,CRAB)的抑菌效果進行研究，以期為中藥治療CRAB感染提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1實驗菌株來源

收集2018年1-4月川北醫學院附屬醫院微生物室鑒定分離的10株CRAB，均為呼吸道來源標本；質控菌株ATCC19606為川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所保存的菌株。

1.1.2儀器和主要試劑、藥品

SJ-CJ-2FD超凈工作臺、THZ-92A恒溫空氣搖床、DHP 420電熱恒溫培養箱、P200+超微量核酸蛋白分析儀、Tecan微孔板酶標儀。魚腥草素鈉(西安開來生物工程有限公司，規格10.0 g，批號K187155)；亞胺培南西司他丁鈉(美國Merck Sharp & Dohme Corp公司，規格1.0 g，其中含亞胺培南500 mg，西司他丁鈉500 mg，批號S026857)；四甲基偶氮唑藍(MTT，德國BioFroxx公司，批號EZ6688D183)；水解酪蛋白(MH)培養基(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)，MH瓊脂培養基(青島高科技工業園海博生物技術有限公司)，二甲基亞砜(DMSO,成都市科隆化學品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1菌懸液制備

將10株CRAB及ATCC19606在MH瓊脂平板中劃線培養9～12 h，挑取單克隆菌落接種于1 mL MH肉湯培養基中，置于37 ℃空氣恒溫搖床(120 r/min)培養10～12 h。將過夜培養的菌液離心(8 000 r/min)3 min，去上清液，加入1 mL生理鹽水重懸菌液；用超微量核酸蛋白分析儀在600 nm處檢測菌液吸光度(A)值，并用生理鹽水將菌液A值調至1.0 (約等于0.5麥氏濁度，菌量約1.5×108cfu/mL)，再用MH液體培養基將菌液稀釋1 000倍，放置于4 ℃冰箱中，30 mim內使用。

1.2.2微量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)

1.2.2.1MH肉湯培養基制備

稱取6.25 g MH肉湯培養基于螺口試劑瓶中，加入250 mL去離子水，震蕩搖勻使培養基溶解，121 ℃高壓滅菌20 min，生物安全柜放涼備用。

1.2.2.2藥物配制

電子天平準確稱取魚腥草素鈉粉劑，加入滅菌MH肉湯培養基，用漩渦震蕩儀震蕩混勻，配制成濃度為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500、5 000、5 500 μg/mL的魚腥草素鈉MH溶液；吸取1 mg/mL的亞胺培南西司他丁鈉原液，按上述方法配制成濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 μg/mL的亞胺培南西司他丁鈉MH溶液；用生理鹽水配制濃度為5 mg/mL MTT溶液，以上溶液用0.25 μm的細菌濾器過濾后備用，放置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2.3接種

取無菌的96孔板，各取20 μL稀釋好的菌懸液和含藥MH液體培養基80 μL接種到96孔板對應的孔中，設置不含細菌的亞胺培南西司他丁鈉藥物對照、不含細菌的魚腥草素鈉藥物對照、不含細菌及藥物的MH陰性對照、不含藥物的細菌陽性對照；每孔液體總體積100 μL，不足者以MH培養基補入。每個藥物濃度設置3個復孔。加樣完畢后置于37 ℃空氣搖床震蕩(100 r/min)培養8～9 h。到達培養時間后，每孔加入10 μL 濃度為5 mg/mL MTT，放置于37 ℃空氣搖床震蕩(100 r/min)培養2 h，加入100 μL DMSO，放置于震蕩(100 r/min)搖床10 min，將肉眼觀察無細菌生長的培養孔所對應的藥物濃度作為相應菌株的MIC。

1.2.3瓊脂二倍稀釋法測定MIC

1.2.3.1含藥MH瓊脂平板制備

制備魚腥草素鈉含藥MH瓊脂平板濃度為250、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 μg/mL,亞胺培南西司他丁鈉含藥MH瓊脂平板濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL。含藥MH瓊脂平板按V藥物∶V瓊脂培養基=1∶9比例，總體積10 mL。用電子天平稱取魚腥草素鈉粉劑所需量及移液槍準確吸取所需亞胺培南西司他丁鈉原液量并加入無菌試管，加入1 mL滅菌MH液體培養基并混勻；MH瓊脂培養基用去離子水溶解后高壓滅菌，待冷卻至60 ℃左右用無菌吸管吸取9 mL至無菌試管，吹打混勻后倒入無菌平板，制成含藥MH瓊脂平板。凝固后密封保存，放置于4 ℃冰箱備用，放置時間不要超過10 d。

1.2.3.2接種

用生理鹽水將過夜培養的10株菌株及ATCC19606的菌液A值調至1.0，并用MH液體培養基將菌液稀釋1 000倍備用。取2 μL接種于劃區的含藥MH瓊脂平板，設置1個平行對照，放入37 ℃孵箱中正面放置30 min，待干后將培養皿倒置，培養9～10 h后，在接種區域加入5 μL濃度為5 mg/mL 的MTT,放置于孵箱中孵育1 h后觀察結果。將肉眼觀察無細菌生長或生長明顯受抑制的培養孔所對應的藥物濃度作為相應菌株的MIC，實驗重復3次。

1.2.4微量肉湯稀釋法-棋盤滴定法檢測聯合抑菌作用

根據MIC值分別設定2種藥物終濃度為2 MIC,1 MIC,1/2 MIC,1/4 MIC,1/8 MIC,1/16 MIC，采用棋盤滴定法測分級抑制濃度。設置藥物對照、MH陰性對照、陽性對照。每孔總體積100 μL，其中魚腥草素鈉80 μL，亞胺培南西司他丁鈉10 μL，菌液10 μL。加樣完畢后放置于37 ℃空氣搖床震蕩(120 r/min)培養9 h，加入MTT 10 μL，放入37 ℃空氣搖床震蕩(120 r/min)培養1 h，加入100 μL DMSO，輕輕震蕩混勻10 min，肉眼觀察以未出現細菌生長的孔對應的濃度為MIC值，實驗重復3次。

1.3.5瓊脂二倍稀釋法檢測聯合抑菌作用

根據菌株單藥時MIC值設定聯合用藥濃度，魚腥草素鈉濃度值為4 000、2 000、1 000、5 00、250、0 μg/mL與亞胺培南西司他丁鈉濃度值80、40、20、10、0 μg/mL聯合用藥組合制作含藥平板，設置陽性對照、空白對照。取2 μL菌液接種于劃區的平皿，設置1個平行對照，放入37 ℃孵箱中正面放置30 min，待干后將培養皿倒置，培養9 h后，在接種區域加入5 μL濃度為5 mg/mL的MTT,放置于孵箱中孵育1 h，觀察結果。將肉眼觀察無細菌生長的培養孔所對應藥物濃度作為相應菌株的MIC，實驗重復3次。

1.3.6部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)和部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index,FICI)計算

2 結 果

2.1 微量肉湯稀釋法和瓊脂二倍稀釋法單藥MIC值

根據肉眼觀察無細菌生長的培養孔對應的藥物濃度作為MIC值，微量肉湯稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉對CRAB的MIC在20～45 μg/mL，瓊脂二倍稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉對CRAB的MIC在25～55 μg/mL。參照臨床實驗室標準化學會耐藥折點藥敏結果判定標準進行結果判讀，10株實驗菌株均為亞胺培南西司他丁鈉耐藥菌株。魚腥草素鈉能抑制CRAB的生長，結果顯示在微量肉湯稀釋法中魚腥草素鈉對CRAB的MIC在1 500～3 500 μg/mL，瓊脂二倍稀釋法中魚腥草素鈉對CRAB的MIC在2 500～3 000 μg/mL。見表1。

2.2 亞胺培南西司他丁鈉和魚腥草素鈉的聯合抑菌效果

本實驗采用2種方法檢測亞胺培南西司他丁鈉(A藥)和魚腥草素鈉(B藥)的聯合抑菌效果，在培養孔中未見細菌生長且FICI≤1時其聯合抑菌效果表現為協同作用。以3號菌株為例，在微量肉湯稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為25 μg/mL,魚腥草素鈉(B藥)MIC值為2 500 μg/mL；在瓊脂二倍稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為80 μg/mL(解釋：瓊脂稀釋法中魚腥草素鈉濃度采用4 000、2 000、1 000、5 00、250、0 μg/mL、亞胺培南西司他丁鈉濃度80、40、20、10、0 μg/mL制作含藥MH瓊脂平板),魚腥草素鈉(B藥)MIC值為4 000 μg/mL，圖1B、圖2C所示白色區域表示對應的培養孔中無肉眼可見細菌生長，且2種藥物聯合時FICI≤1；3號菌株FICI在0.5～1.0，根據FICI值判讀2種藥物對3號菌株的聯合抑菌效果為協同作用,見圖1、2。

表1 微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法單藥MIC值(μg/mL)

A:微量肉湯稀釋法-棋盤滴定法檢測聯合抑菌作用;B:3號菌株聯合用藥結果。亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為25 μg/mL,魚腥草素鈉(B藥)MIC值為2 500 μg/mL。B圖黑色區域表示對應的孔中有肉眼可見的細菌生長；灰色區域表示對應孔中無細菌生長，且FICI>1.00；白色區域中孔中無肉眼可見細菌生長，且FICI在0.50～1.00。3號菌株FICI在0.50～1.00，兩種藥物對3號菌株的聯合抑菌效果為相加作用。

2.3 FIC和最優FICI

魚腥草素鈉對CRAB的FIC值與亞胺培南西司他丁鈉對CRAB的FIC值相加，將數值最小的FICI值作為最優部分抑菌濃度指數，結果顯示在微量肉湯稀釋法和瓊脂二倍稀釋法中，其最優FICI值在0.5～1.0，均表現為相加作用。在微量肉湯稀釋法中，亞胺培南西司他丁鈉與不同濃度魚腥草素鈉聯合時，亞胺培南西司他丁鈉MIC值可下降1～3個稀釋濃度；在瓊脂二倍稀釋法中亞胺培南西司他丁鈉與魚腥草素鈉聯用其MIC值可下降1～2個稀釋濃度。根據FICI值結果判讀標準，魚腥草素鈉聯合亞胺培南西司他丁鈉對10株CRAB的聯合用藥效果均表現為相加作用，且2種實驗方法評價結果一致。見表2。

A:瓊脂二倍稀釋法檢測聯合抑菌作用;B:瓊脂二倍稀釋法接種示意圖;C:3號菌株聯合用藥結果。亞胺培南西司他丁鈉(A藥)MIC值為80 μg/mL,魚腥草素鈉(B藥)MIC值為4 000 μg/mL。C:黑色區域對應的孔中有肉眼可見的細菌生長；灰色區域對應孔是魚腥草和培養基的顏色其中無細菌生長，且FICI>1.00；白色區域對應孔中無肉眼可見細菌生長，且FICI在0.50～1.00。3號菌株FICI在0.75～1.00，2種藥物的聯合抑菌效果為相加作用。

表2 微量肉湯稀釋法和瓊脂二倍稀釋法聯合抑菌最優FICI結果

3 討 論

隨著社會老齡化趨勢，醫院中高齡的重癥患者、多基礎疾病患者數量增加，住院時間長、侵入性檢查治療等危險因素導致醫院鮑曼不動桿感染率上升[7]。亞胺培南是碳青霉烯抗生素的代表藥物，是非典型β-內酰胺類抗生素，其具有殺菌能力強、超廣譜抗菌活性等優點[8]，是治療鮑曼不動桿菌感染的常選藥物。但隨著亞胺培南西司他丁鈉在臨床上的廣泛使用，以及鮑曼不動桿菌天然感受態特性，使其擁有獲得外源性耐藥基因的能力，CRAB的檢出率不斷上升。鮑曼不動桿菌的耐藥機制與產生抗菌藥物相關的酶類、藥物作用靶點改變、膜孔道蛋白的缺失、外排泵過度表達、可移動遺傳元件如整合子、生物被膜等因素有關[9]。多重耐藥鮑曼不動桿菌感染可供選擇的抗菌藥物很少，即使菌株對替加環素和多粘菌素的敏感率相對較高，但單藥治療失敗率高，且這些藥物不良反應大。多粘菌素常見的不良反應有腎毒性，會造成急性腎損傷[10];替加環素最常見不良反應有惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道反應[11]，給鮑曼不動桿菌感染的治療帶來困境。

隨著細菌耐藥形勢的加劇，越來越多的目光聚集到傳統醫學。傳統醫學中抗菌植物是新型抗菌化合物的重要來源，世界范圍內批準的藥物中大部分來源于天然產品，大部分藥物都是從天然植物中提取的[12]。魚腥草具有“中藥抗生素”之稱，其魚腥草注射液臨床上常用于上呼吸道感染、盆腔炎、尿路感染等疾病的治療且價格便宜，但由于其可能導致嚴重過敏反應，限制了臨床的廣泛應用。中藥復方制劑成分和藥理作用復雜多樣，可能造成藥物不良事件。魚腥草素鈉在臨床用藥上以靜脈注射、肌肉注射效果優于口服用藥，但用藥安全性和有效性的問題仍需解決，中藥單體因純度高、成分明確、活性高成為研究的重點。魚腥草素鈉具有抗氧化、抗腫瘤、調節免疫力、抑菌、抗病毒的作用[13]，對多種革蘭陽性細菌和革蘭陰性細菌如金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、卡他球菌、白喉桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、腸炎桿菌等均有不同程度的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌及枯草桿菌的抑菌結果較強[14]；魚腥草素鈉可增強金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌生物被膜早期黏附的清除作用，抑制生物被膜形成[15]。

綜上，本研究結果顯示魚腥草素鈉能抑制耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生長，在微量肉湯稀釋法中檢測到MIC在1 500～3 500 μg/mL，瓊脂二倍稀釋法中MIC在2 500～3 000 μg/mL，與亞胺培南西司他丁鈉聯用后能增加其抑菌效果，使亞胺培南西司他丁鈉的MIC下降，其最優FICI在0.5～1.0，2種藥物聯合效應為相加作用。采用微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法2種方法進行體外抑菌實驗，2種方法結果一致。但是魚腥草素鈉的抑菌機制目前暫不清楚，可能與抑制細菌生物被膜形成有關、抑制細菌主動外排泵、消除耐藥質粒等有關，其機制需要進一步進行研究。