普羅布考對高脂血癥大鼠腦缺血再灌注的腦保護作用及機制研究*

王建平，張 杰，趙洪云

(河北省滄州市中心醫院：1.神經內科；2.CT診斷科 061000)

腦卒中亦稱“中風”，是1種急性腦血管疾病，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中，缺血性腦卒中占全部腦血管疾病的70%～80%，具有高發病率、高致殘率、高死亡率、高復發率等特征[1]。大動脈粥樣硬化狹窄是缺血性腦卒中最常見的亞型，高脂血癥是腦動脈狹窄的高危因素[2-3]。目前，臨床上有效治療缺血性腦卒中的手段是在時間窗內通過溶栓或取栓等恢復半暗帶的血氧供應，使閉塞血管血液得到再灌注，減輕腦組織缺血缺氧的損傷，改善患者預后[4]。但再灌注同時會加重缺血細胞損傷，甚至發展為不可逆損傷即腦缺血再灌注損傷[5]。因此，尋找有效減輕腦缺血再灌注損傷的藥物對提高缺血性腦卒中的治療效果，改善患者預后具有重要意義。普羅布考是1種新型降脂藥物，具有抗氧化、抗炎，抑制動脈粥樣硬化因子表達，減少動脈粥樣硬化斑塊及提高血管內皮舒張功能等作用[6-7]。近年研究顯示，普羅布考在腦出血高風險的缺血性腦卒中患者治療中發揮了重要作用[8]。本研究擬通過建立高脂血癥大腦中動脈阻斷大鼠模型經普羅布考治療并檢測相關指標，探討普羅布考對其腦缺血再灌注的腦保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

無特定病原體(SPF)級SD大鼠140只，雌雄各半，7周齡，體重(220±20 g)，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2016-0011。飼養環境：溫度20～25 ℃，相對濕度45%～55%，光照周期12 h，根據國家實驗動物管理條例進行喂養。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.1.2藥品、主要試劑和儀器

普羅布考0.25 克/片(承德頸復康藥業集團有限公司)；TTC(美國Sigma公司)；大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(美國R&D公司)；兔抗鼠p-p65、NF-κB p65、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔二抗(英國Abcam公司)；全自動生化分析儀及配套試劑(山東科生物產業有限公司)；多功能酶標儀(美國Molecular Device公司)；蛋白凝膠電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與模型制備[9]

140只SD大鼠分為：普通組(20只)，高脂組(120只)，采用自然進食法制備高脂血癥模型。普通組給予普通飼料喂養，高脂組給予高脂飼料(基礎飼料79.3%、蛋黃粉10%、膽固醇5%、豬油5%、豬膽鹽0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%)喂養8周，空腹12 h后取大鼠尾尖靜脈血，全自動生化分析儀及配套試劑檢測其血脂四項：總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(low-density lipid cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(high-density lipid cholesterol，HDL-C)。

1.2.2分組及干預

120只造模成功的高脂血癥大鼠采用隨機數字表法分為：高脂組、缺血再灌注組、低劑量普羅布考組、高劑量普羅布考組，每組30只。普羅布考低劑量組、普羅布考高劑量組分別給予0.5%羧甲基纖維素(CMC)配制的普羅布考混懸液100 mg/kg、500 mg/kg灌胃，高脂組、缺血再灌注組同時給予相同劑量不含普羅布考的0.5% CMC灌胃，1次/天，連續4周。

1.2.3建立大腦中動脈阻斷模型[10]

缺血再灌注組、普羅布考低劑量組、普羅布考高劑量組采用改良Longa法建立大腦中動脈阻斷模型，10%水合氯醛腹腔麻醉后，經頸正中切口，依次分離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，結扎頸外動脈及頸總動脈近心端，在距頸總動脈分叉5 mm處剪一“V”形切口，將處理好的魚線插入頸總動脈，深度約18 mm，至大腦中動脈，結扎并固定魚線，縫合皮膚，阻斷血流2 h后，分別拔出魚線進行再灌注。假手術組大鼠除不插魚線外，其余步驟同前，根據Longa評分標準判斷造模是否成功。評分原則，0分：表現正常，無明顯神經功能缺損癥狀和體征；1分：左前肢屈曲無力，不能完全伸直；2分：行走向左側旋轉；3分：行走時向左側傾倒，站立不穩；4分：不能自行行走，意識障礙。1～3分大鼠為造模成功。缺血再灌注組術后死亡2只，蛛網膜下腔出血死亡1只；普羅布考低劑量組和普羅布考高劑量組分別因蛛網膜下腔出血死亡1只。

1.2.4各組大鼠神經功能缺損評分

造模成功大鼠根據再灌注不同時間點(6、12、24、48、72 h)分為5個亞組，每組取5只，對大鼠進行提尾反射測試、行走測試、感覺測試、平衡性測試、反常運動和反射缺失測試。根據Garcia評分細則[11]進行神經功能缺損評分(modified neurological severity score，mNSS)，得分最低3分，最高18分，分數越低表示神經功能障礙越重。

1.2.52，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測各組大鼠腦梗死體積

造模成功大鼠缺血再灌注后24 h每組取5只，10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，快速斷頭取腦，將新鮮腦組織置于-20 ℃冰箱20 min，腦組織切去小腦及低位腦干，沿腦組織冠狀面依次切成2 mm厚的切片，立即放于2% TTC磷酸緩沖液中，37 ℃避光染色30 min，4%甲醛固定，將已染色的腦組織規律擺放，進行照相后采用Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件進行分析，計算腦梗死體積比(V)。計算公式：V=[(A1+A2)/2×t)]/[(A3+A4)/2×t)]×100%，其中，A1和A2為各腦片正反面梗死面積(mm2)，A3和A4為各腦片正反面面積(mm2)，t為切片厚度(mm)。

1.2.6ELISA檢測缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平

取部分缺血腦組織，勻漿器將其充分勻漿，3 000 r/min(離心半徑8 cm)離心20 min，收集上清液。設置空白孔、標準品孔及樣品孔，標準品孔加50 μL梯度稀釋的標準品，樣品孔先加40 μL樣品稀釋液，再加10 μL樣品，振蕩混勻后封板，37 ℃孵育30 min，洗滌液清洗5次，除空白孔外每孔加50 μL酶標試劑，混勻后封板，37 ℃孵育1 h，洗滌液清洗5次，每孔加100 μL顯色液，混勻后37 ℃避光顯色20 min，標準品孔出現顏色梯度變化時，每孔加50 μL終止液，15 min內以空白孔調零，酶標儀450 nm波長外測量各孔光密度(OD)值，以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，采用CurveExpert軟件繪制標準曲線，計算樣品中TNF-α、IL-1β水平，實驗重復3次。

1.2.7Western blot檢測缺血腦組織NF-κB通路相關蛋白表達水平

取120 mg冷凍缺血腦組織，液氮研磨后加RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白煮沸變性，取等量總蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳，電泳條件：80 V恒壓電泳濃縮蛋白20 min，100 V恒壓電泳分離蛋白約1 h至溴酚藍接近蛋白膠板底端，轉膜儀將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉膜條件：300 mA恒流轉膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別用1∶1 000稀釋的p-p65、NF-κB p65、β-actin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再用1∶2 000稀釋的過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發光液浸膜，暗室曝光顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 普通組與高脂血癥組大鼠血脂四項

大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平組間比較，差異有統計學意義P<0.05)。與普通組比較，高脂血癥組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低(P<0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠mNSS

大鼠mNSS組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較，缺血再灌注組大鼠再灌注不同時間點mNSS降低(P<0.05)；與模型組比較，普羅布考低劑量組、普羅布考高劑量組大鼠再灌注不同時間點mNSS升高(P<0.05)；與普羅布考低劑量組比較，普羅布考高劑量組大鼠再灌注6、48、72 h mNSS升高(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠血脂四項水平比較

表2 各組大鼠再灌注后不同時間點神經功能缺損評分分，n=5)

2.3 各組大鼠腦梗死體積

大鼠腦梗死體積組間比較，差異有統計學意義(F=305.905，P<0.001)。與缺血再灌注組[(178.59±15.53)mm3]比較，普羅布考低劑量組[(119.82±10.42)mm3]、普羅布考高劑量組[(97.34±11.61)mm3]大鼠腦梗死體積減小(P<0.05)；與普羅布考低劑量組比較，普羅布考高劑量組大鼠腦梗死體積減小(P<0.05)。

2.4 各組大鼠缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平

大鼠缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較，缺血再灌注組大鼠缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，普羅布考低劑量組、普羅布考高劑量組大鼠缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)；與普羅布考低劑量組比較，普羅布考高劑量組大鼠缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)。見表3。

2.5 各組大鼠缺血腦組織NF-κB通路相關蛋白表達水平

大鼠缺血腦組織p-p65蛋白表達水平組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與假手術組比較，缺血再灌注組大鼠缺血腦組織p-p65蛋白表達水平升高(P<0.05)；與缺血再灌注組比較，普羅布考低劑量組、普羅布考高劑量組大鼠缺血腦組織p-p65蛋白表達水平降低(P<0.05)；與普羅布考低劑量組比較，普羅布考高劑量組大鼠缺血腦組織p-p65蛋白表達水平降低(P<0.05)，各組大鼠缺血腦組織NF-κB p65蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P<0.05)。見圖1，表4。

表3 各組大鼠缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平

A：假手術組;B：缺血再灌注組;C：普羅布考低劑量組;D：普羅布考高劑量組。

表4 各組大鼠缺血腦組織NF-κB p65、p-p65 蛋白表達水平

3 討 論

腦血管病是全球主要的健康問題之一，包括腦動脈粥樣硬化、腦動脈炎、腦動脈損傷、腦動脈瘤、顱內血管畸形和腦動靜脈瘺等，大、小腦血管病變均可觸發腦卒中[12]。目前，我國每年腦血管病新發病例約250萬，死亡人數約150萬，而大概75%幸存患者留有不同程度的后遺癥[6]。其中，缺血性腦卒中是由于頸動脈和椎動脈等腦部供血動脈狹窄、閉塞引起腦組織缺血缺氧及缺血再灌注導致的炎性反應、酸中毒、自由基生成等一系列病理變化[13-15]。腦缺血再灌注損傷包括血管通透性增加、血腦屏障破壞和腦水腫等，是導致缺血性腦卒中患者預后不良的關鍵因素[16]。缺血性腦卒中患者死亡的腦細胞周圍存在大量神經元，因此有效恢復血氧供應，減小動脈斑塊面積，減輕神經細胞損傷及降低血脂可以顯著改善患者的神經功能。臨床上常以靜脈溶栓和血管內血栓切除術進行快速再灌注，以及血壓控制、膽固醇管理和抗血栓藥物等二級預防方式[17]進行處理。

普羅布考是1種具有抗氧化和抗炎特性的酚類化合物降脂劑，已用于臨床治療和預防心血管疾病[18]。NAKAGAWA 等[19]研究表明，普羅布考在體外血腦屏障模型中可減輕氧糖剝奪/復氧引起的跨內皮電阻降低和通透性增加；在小鼠大腦中動脈阻斷再灌注模型中可減小術后腦梗死面積和血管滲漏并保持緊密連接蛋白的完整性。楊成等[20]研究發現，普羅布考可以提高缺血再灌注損傷大鼠血及腎組織中超氧化物歧化酶活性，改善腎功能，降低血脂水平，減輕腎組織病理損傷，發揮腎臟保護作用。曾洪艷等[21]研究顯示，普羅布考可通過轉化生長因子β1/Smad2/3通路減輕大鼠腦缺血再灌注的炎性損傷。本研究建立高脂血癥大腦中動脈阻斷大鼠模型，經普羅布考治療后發現大鼠腦缺血再灌注不同時間點mNSS升高、腦梗死體積減小，缺血腦組織TNF-α、IL-1β水平降低，提示普羅布考可減輕高脂血癥大鼠腦缺血再灌注損傷，發揮腦保護作用。

NF-κB是1種早期核轉錄因子，通過與靶基因啟動子/增強子區域的特定序列結合并啟動基因轉錄。靜息狀態下，NF-κB通常以p50/p65二聚體形式與NF-κB抑制劑(IκB)結合形成無活性異源復合體存在于細胞質中，細胞外信號刺激下，IκB激酶復合體將IκB磷酸化，復合體解離并釋放NF-κB，游離的NF-κB從細胞質轉移至細胞核，p65亞基與靶基因κB結合位點結合啟動或增強基因如TNF-α、IL-1β等的轉錄，導致炎性反應[22]。LIANG等[23]研究發現，遠程缺血預處理可通過調控NF-κB通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，發揮神經保護作用。WU等[24]研究表明，長春西汀通過調控Toll樣受體4/髓樣分化因子88/NF-κB通路抑制炎性反應，減輕腦缺血再灌注損傷。本研究結果顯示，經普羅布考治療后，高脂血癥大腦中動脈阻斷大鼠缺血腦組織p-p65蛋白表達水平降低，提示普羅布考可能通過調控NF-κB通路發揮對高脂血癥大腦中動脈阻斷大鼠缺血再灌注的腦保護作用。

綜上所述，普羅布考對高脂血癥大鼠腦缺血再灌注具有腦保護作用，其機制可能與調控NF-κB通路及下游相關炎癥因子的表達有關。本研究為普羅布考應用于高脂血癥合并缺血性腦卒中的臨床治療提供理論支持。