普羅布考對腦出血模型小鼠血腫周圍腦組織MST1和LATS1及YAP蛋白表達的影響*

董曉柳,劉蔚然,高 銘,司味鑫,張秀清,宋麗華,張 利,董 偉

(河北省唐山市人民醫院：1.神經康復科;2.神經外科 063000)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外傷性腦實質內出血，臨床癥狀主要表現為腦卒中發作，出現頭痛、嘔吐、偏身癱瘓及(或)感覺障礙甚至意識障礙等，僅有20%的患者在ICH后6個月達到功能獨立[1-2]，是死亡率和致殘率較高的疾病。因此，截至目前ICH的防治仍是我國疾病防控的重點。普羅布考不僅具有降脂、抗氧化等作用，亦具有抗炎、減輕腦水腫、改善認知功能、減輕神經功能障礙等腦保護作用[3]，但其發揮保護作用的具體機制目前尚不完全清楚。Hippo信號通路是首次在果蠅體內被發現[4]，在組織修復、調控組織器官大小、調節細胞增殖與凋亡等方面具有重要的作用[5]。哺乳動物不育系20樣激酶(MST1)是Hippo信號通路的核心組件，大腫瘤抑制因子1(LATS1)是Hippo通路的核心激酶[6]，其下游分子Yes相關蛋白-1(YAP)是Hippo通路的主要轉錄調控激活因子[7]。有研究報道，在ICH中，抑制Hippo通路可減輕腦損傷[8]。然而，普羅布考是否通過Hippo通路在ICH腦損傷中發揮保護作用目前尚不明確。因此本研究通過觀察普羅布考對MST1和LATS1及YAP表達的影響，為急性期ICH臨床治療尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

正常健康雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重20～25 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：SCXK(京)2019-0008]。實驗動物在華北理工大學屏障環境動物實驗室由專人飼養，飼養條件為通風，清潔，自然光線12 h/12 h晝夜交替照明，晝夜室溫控制在20～25 ℃，相對濕度控制在45%～55%，分籠飼養，避免強光及噪音，給予充足自來水和標準顆粒飼料喂養。動物適應性喂養7 d后進行造模，在實驗設計及實際操作過程中盡可能降低實驗動物的需要量，盡量避免實驗動物因不合理操作導致死亡，同時減輕其在實驗過程中所承受的痛苦。

1.2 藥物與試劑

普羅布考片(齊魯制藥有限公司，批準文號：國藥準字H10980054)；兔抗MST1抗體、兔抗p-MST1抗體、兔抗p-YAP抗體、兔抗YAP抗體、兔抗p-LATS1、兔抗LATS1(美國Cell Signaling Technology公司，貨號：49332、14946、13008、14074、8654、3477)；兔抗Neun抗體(美國Abcam公司，批號：ab177487)；兔抗β-肌動蛋白抗體、HRP標記的山羊抗兔二抗(北京中山金橋，貨號：TA-09、87768)；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)試劑盒、伊文思藍(EB)染液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：T2190、314-13-6)。

1.3 主要儀器

腦立體定位儀(北京金洋萬達科技有限公司)；Tissuelyser-192組織勻漿儀(上海凈信實業發展有限公司)；12003153型凝膠成像儀、酶標儀(美國Bio-Rad公司)。CM1900型冰凍切片機(德國Leica公司)；免疫熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；-80 ℃冰箱(海爾公司)；恒溫水浴箱(美國Amersham Biosicences公司)。

1.4 動物分組及給藥方法

采用隨機數字表法將實驗小鼠分為假手術組(sham組)、ICH模型組(ICH組)、ICH模型+普羅布考治療組(ICH+PB組)，每組18只。ICH+PB組于造模后6 h開始灌胃給藥普羅布考(500 mg·kg-1·d-1)，sham組和ICH組于相應時間點給予等體積的生理鹽水。

1.5 模型制備

采用膠原酶法制作小鼠ICH模型[9]。將0.037 5 U的細菌膠原酶溶于0.5 μL 0.9%生理鹽水，避光放置于冰上備用。造模前12 h禁食，4 h禁飲，5%水合氯醛(0.7 mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，將其固定在腦立體定位儀上，沿矢狀位作一長1 cm的皮膚切口，前囟為原點，向前0.5 mm、向右2.3 mm處鉆一直徑為1 mm小圓孔作為注射孔，將吸入細菌膠原酶溶液的微量注射器固定好，針頭沿注射孔垂直緩慢插入腦實質，深度約3.7 mm，以0.5 μL/min的速度注入細菌膠原酶溶液，注射完畢后停針10 min，緩慢向上拔針，每向上拔針1 mm停針5 min，直至全部拔出[10]。最后用骨蠟封閉注射孔，手術線縫合傷口，碘伏消毒。sham組除不注射細菌膠原酶溶液外，其余操作均與ICH組一致。根據BEDERSON等[11]的評定方法分為3級，0級：沒有神經缺失癥狀；1級：提尾，癱瘓側前肢回收屈曲腹下，健側前肢向地面伸展；2級：除了有1級體征外，向癱瘓側推小鼠時手所受到的阻力較對側明顯變小；3級：除以上體征外，小鼠行走時向癱瘓側旋轉或傾倒。ICH后1 h對小鼠進行評定。評定達1、2、3級判斷為造模成功。

1.6 神經功能行為學評價

神經功能評估采用改良的神經功能損傷(mNSS)評分，主要內容包括感覺、運動、反射及平衡功能[12]等，分別在ICH后第1、3天分別進行。0分無神經功能缺損；1～6分為輕度神經功能缺損；7～12分為中度神經功能缺損；13～18分為重度神經功能缺損。

1.7 腦組織含水量測定

采用經典干濕重法測量各組小鼠腦組織含水量，含水量的多少可以反映腦水腫的嚴重程度。于ICH后第3天水腫高峰期時，采用頸椎脫臼法處死小鼠，取新鮮腦組織，自中線將大腦切分為左右兩個半球，并分離出小腦組織。電子天平稱得3部分組織濕重并記錄(精確到0.1 mg)。測完后分別用錫紙包裹好，迅速置于100 ℃烤箱中，24 h后再稱重，此時稱得的重量即為干重。計算腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8 血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)滲透性測定

采用EB作為示蹤劑來評估BBB滲透性。于ICH后第3天，尾靜脈注射2% EB(2 mL/kg)，注射成功標志：小鼠鞏膜、耳廓、手掌、腳掌等部位迅速變為藍色。注射成功2 h后，行心臟灌注后斷頭取腦，去掉嗅球及小腦，將取得的大腦半球在精度為0.1 mg的電子天平上稱質量后將腦組織勻漿，并將其加入裝有5 mL二甲基甲酰胺的試管中，于60 ℃恒溫水浴鍋孵育72 h，離心棄去沉淀，取上清液檢測。采用分光光度計于波長450 nm的波譜處分析、測定吸光度(A)值，繪制標準曲線，根據以下方程計算腦組織EB含量：腦組織中EB含量(μg/g) =EB濃度×二甲基甲酰胺體積(mL)/濕重(g)。

1.9 神經元細胞凋亡檢測方法

采用TUNEL法檢測神經元細胞凋亡情況。于ICH后第3天，行心臟灌注取腦，腦組織冰凍切片均采用0.3% Triton-X100打孔，3%牛血清清蛋白(BSA)封閉，PBS洗3次，每次5 min ，滴加神經元標志性蛋白Neun一抗(1∶500)，4 ℃過夜，在預先混合好的TUNEL反應液中加入熒光二抗，滴加40 μL于玻片上，37 ℃濕盒內避光孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，封片，熒光顯微鏡下觀察免疫熒光結果。

1.10 MST1、LATS1、YAP表達情況檢測

采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測血腫周圍腦組織MST1、LATS1和YAP的表達變化。于給藥后第3天，行心臟灌注取腦，取200 mg腦組織，加入1 mL預冷的(RIPA)緩沖液及10 μL 苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解組織，組織勻漿儀研磨后，冰上放置30 min。將勻漿好的腦組織移入離心管中，離心，取上清液。應用蛋白濃度測量儀測定蛋白濃度，將提取的蛋白加入4×上樣緩沖液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用TBST于搖床上搖洗3次，每次10 min，洗完后將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的容器中，常溫慢搖1 h進行封閉。將膜與一抗(兔抗MST1抗體稀釋比例1∶1 000；兔抗p-MST1抗體稀釋比例1∶1 000；兔抗P-YAP抗體稀釋比例1∶1 000；兔抗YAP抗體稀釋比例1∶1 000；兔抗P-LATS1稀釋比例1∶1 000；兔抗LATS1稀釋比例1∶1 000；兔抗β-肌動蛋白抗體稀釋比例1∶2 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜3次，分別加入二抗(HRP標記山羊抗兔抗體稀釋比例1∶5 000)，室溫孵育1 h。使用增強型化學發光(美國Cell Signaling Technology公司)試劑使印跡可視化。Bio-rad Quantity One4.4.0成像儀顯影。目的條帶采用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.11 統計學處理

2 結 果

2.1 神經功能評分比較

與sham組比較，ICH組小鼠在ICH后第1、3天mNSS評分明顯增加(P<0.01)；與ICH組比較，ICH+PB組小鼠在ICH后第1、3天mNSS評分明顯減低(P<0.05)。見圖1。

a：P<0.01，與sham組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與ICH組比較。

2.2 BBB滲漏性測定

與sham組比較，ICH組小鼠在ICH后第3天EB含量明顯增加(P<0.01)；與ICH組比較，ICH+PB組小鼠在ICH后第3天EB含量明顯降低(P<0.05)。見圖2。

a：P<0.01，與sham組比較；b：P<0.05，與ICH組比較。

2.3 凋亡細胞數檢測

與sham組比較，ICH組小鼠在ICH后第3天血腫周圍腦組織神經元細胞數凋亡明顯增加(P<0.01)；與ICH組比較，ICH+PB組小鼠在ICH后第3天血腫周圍腦組織神經元細胞數凋亡明顯減少(P<0.05)。見圖3。

2.4 MST1、LATS1、YAP表達檢測結果

與sham組比較，ICH組小鼠在ICH后第3天血腫周圍腦組織p-MST1、p-LATS1及p-YAP表達水平明顯增加(P<0.05)；與ICH組比較，ICH+PB組小鼠在ICH后第3天血腫周圍腦組織p-MST1、p-LATS1及p-YAP表達水平明顯減低(P<0.05)。見圖4。

A：TUNEL熒光圖；B：血腫周圍組織；C：血腫周圍神經元細胞凋亡分析；a：P<0.01，與sham組比較；b：P<0.05，與ICH組比較。

A、B、C：Western blot圖；D、E、F：Western blot定量分析圖；a：P<0.01，與sham組比較；b：P<0.05，與ICH組比較。

3 討 論

ICH后腦損傷機制主要包括各種信號通路的激活，從而引發細胞的凋亡或者壞死。許多研究表明神經元細胞的凋亡和損傷是ICH后神經功能缺失的機制之一[13]，是ICH后神經功能進行性發展、惡化的直接原因[14]。ICH后正常腦組織結構遭到破壞，從而引發BBB完整性破壞，導致有害物質進入腦組織從而造成腦損害。研究表明，ICH后繼發的腦水腫危害巨大，是導致神經功能障礙的關鍵因素，其中BBB的破壞引起的血管源性腦水腫是繼發性腦水腫的主要環節[15]，并且BBB的破壞又能促進細胞凋亡、炎性反應、氧化應激的放大等[16-17]，從而加重ICH后多種繼發性神經損害。既往動物實驗研究表明，ICH后第3天出現腦水腫和細胞凋亡高峰[18]，一般最多持續10～14 d[19]。故本實驗選擇在ICH后第3天檢測腦組織BBB滲透性及神經元細胞凋亡情況，以評估腦損傷程度及給予干預措施后的治療效果。

普羅布考屬于新型調脂藥，相對分子質量小，易透過BBB。其作用除了調脂、抗氧化以外還具有下調炎癥因子表達[20]、改善血管內皮功能[21]、改善認知[22]、清除氧自由基、抗神經細胞凋亡[23]等作用。研究表明，在缺血再灌注模型中[24]，給予普羅布考進行干預后可減少梗死面積和血管滲漏，保持BBB的完整性，起到抗神經元細胞凋亡、改善神經功能障礙的作用。在血管性癡呆和阿爾茨海默病(AD)的早期，給予普羅布考可降低BBB通透性，從而改善認知[25]。在生理狀態下EB在血管內與蛋白結合，很難進入腦組織，只有在BBB結構受損、通透性升高的情況下，EB才能進入腦組織，因此腦組織內EB含量可用來衡量BBB通透性的程度。本研究發現，ICH后小鼠BBB通透性明顯升高，腦組織EB含量升高，經普羅布考干預3 d后，小鼠腦組織EB含量明顯降低，同時神經功能障礙得到改善，提示普羅布考可減輕ICH所致的腦損害。

Hippo通路由絲氨酸激酶級聯反應組成，通過激酶之間的相互作用和級聯磷酸化來傳導信號。Hippo通路可調控與生長相關的基因，參與細胞的增殖和凋亡過程，控制組織器官中細胞的數量和組織的大小。在哺乳動物中，Hippo通路的激活，可導致p-MST1水平升高，p-MST1與Sav形成復合物，可以磷酸化并激活LATS1，繼而磷酸化YAP/TAZ使p-YAP/TAZ靜置在細胞質中[26]，因此YAP1的凋亡抑制作用將會消失[27]，相反，YAP/TAZ去磷酸化可以使其發生核轉位并激活轉錄因子促進細胞增殖、抑制凋亡[28]。既往研究表明，在ICH血模型中[29]，Hippo信號通路的抑制可緩解缺血缺氧造成的BBB損傷，起到神經保護作用。在ICH模型中，Hippo信號通路的抑制可減輕ICH期間的腦水腫、BBB損傷和神經功能障礙[30]。本研究發現，ICH后血腫周圍腦組織p-MST1、p-LATS1及p-YAP表達水平明顯上升、EB滲漏增加、神經元細胞凋亡數明顯增多，與既往研究一致。給予普羅布考干預后，與ICH組比較，血腫周圍腦組織中p-MST1、p-LATS1及p-YAP表達水平明顯下降，說明普羅布考可起到抑制Hippo通路的作用，并且給予普羅布考后EB滲漏降低、神經元細胞凋亡數減少，從而推測普羅布考可能通過抑制Hippo通路從而起到腦保護作用。

綜上所述，普羅布考對ICH模型小鼠具有腦保護作用，該作用可能是通過抑制Hippo通路而發揮保護BBB、抗神經元細胞凋亡、改善神經功能障礙的作用，從而減輕腦損傷。