瑞芬太尼調控Linc00462/miR-2355-5p對腎癌細胞生物學行為的影響*

文 竹，李 軍，何 潔

(電子科技大學醫學院附屬綿陽醫院/綿陽市中心醫院麻醉科,四川綿陽 621000)

腎癌(RCC)是泌尿系統常見的惡性腫瘤，近年其發病率呈上升趨勢。手術、放療和分子靶向治療的應用在一定程度上改善了RCC患者生存現狀，但其5年生存率仍非常低，其中遠處轉移和復發是RCC患者治療失敗和復發的主要原因[1]。瑞芬太尼是μ-阿片類全身麻醉藥物，具有麻醉起效快、鎮痛作用強、代謝快、不良反應少等優勢。近年研究表明，瑞芬太尼可抑制T淋巴細胞增殖和炎癥因子釋放，從而緩解結腸癌患者術后氧化應激和炎性反應[2]。此外，瑞芬太尼通過激活糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)誘導膠質瘤細胞凋亡[3]，并通過上調微RNA-206(miR-206)、miR-519d-3p表達水平抑制胃癌細胞增殖并誘導凋亡[4-5]。然而瑞芬太尼抗RCC的相關研究十分有限。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度超過200 nt但不編碼蛋白的RNA分子，其參與基因調控和腫瘤細胞穩態的各個方面，可能表現出腫瘤抑制和促進功能[6]。研究發現基因間lncRNA00462(Linc00462)在肝癌中顯著上調，并通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)通路增強肝癌細胞侵襲表型[7]。但目前Linc00462在RCC中的表達和功能尚不清楚。miR-2355-5p在膀胱癌中表達水平減少，過表達miR-2355-5p能夠抑制膀胱癌細胞惡性表型[8]。但目前Linc00462、miR-2355-5p在RCC中的表達和功能尚未見研究。本研究通過觀察瑞芬太尼、Linc00462對RCC細胞786-0增殖、遷移、侵襲的影響，旨在揭示瑞芬太尼在RCC中的抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

RCC細胞786-0購自美國ATCC公司；瑞芬太尼購自江蘇恩華藥業股份有限公司；Linc00462小干擾RNA(si-Linc00462)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、Linc00462過表達載體(pcDNA-Linc00462)、熒光素酶報告質粒由上海吉凱基因公司合成或生產；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自南京森貝伽生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；E-cadherin兔抗單克隆抗體、N-cadherin兔抗單克隆抗體、GAPDH兔抗多克隆抗體購自美國Abcam公司；miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒購自上海聯邁生物工程公司；化學發光試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；Prime Script逆轉錄試劑盒、SYBR Prime Script實時熒光定量(RT-qPCR)試劑盒、miRNA cDNA合成試劑盒購自大連寶生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和實驗分組

786-0細胞用含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37 ℃、含5% CO2、濕度飽和的培養箱培養。胰酶消化80%融合細胞，1∶3傳代。以3×105/孔的細胞密度接種對數期786-0細胞至6孔板，參照LipofectamineTM 2000說明書分別轉染si-NC、si-Linc00462、pcDNA-Linc00462至50%融合的786-0細胞，轉染48 h用RT-qPCR檢測轉染效果后進行下一步實驗。實驗分組，對照組：正常培養的786-0細胞；瑞芬太尼10 nmol/L組、瑞芬太尼20 nmol/L組、瑞芬太尼40 nmol/L組：分別用含有10、20、40 nmol/L瑞芬太尼[4]的培養液孵育細胞24～72 h；si-NC組、si-Linc00462組、pcDNA-Linc00462組：分別轉染si-NC、si-Linc00462、pcDNA-Linc00462的786-0細胞；瑞芬太尼+pcDNA-Linc00462組：用含40 nmol/L瑞芬太尼的培養液孵育轉染pcDNA-Linc00462的細胞48 h。

1.2.2MTT法檢測細胞活力

以6×103/孔的密度接種786-0細胞至96孔板，分別用含10、20、40 nmol/L瑞芬太尼的培養液孵育細胞，在培養24、48、72 h時分別取出1板細胞，每孔加入20 μL的MTT，孵育4 h后終止培養，吸盡孔內培養液。每孔內加入150 μL的二甲基亞砜，至搖床上低速震蕩10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。

1.2.3克隆形成實驗檢測細胞克隆能力

以500/孔的細胞密度接種786-0細胞至6孔板，輕輕抖動平板使細胞分散均勻，放入培養箱常規培養直至出現細胞集落。用甲醇固定集落10 min，結晶紫染色15 min，顯微鏡下計數含有50個以上細胞的集落數。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲

將各組786-0細胞重懸于無血清培養基中，取100 μL細胞懸液轉移至未包被(遷移)或包被(侵襲)基質膠的Transwell上室，下室中加入約600 μL含10%胎牛血清的培養基。培養24 h后，用甲醇固定Transwell底部膜表面細胞，用結晶紫染色，光鏡下計數5個視野細胞數總和，以均值表示細胞侵襲或遷移數。

1.2.5蛋白免疫印記(Western blot)檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

用預冷的PBS洗滌各組786-0細胞1次，于冰上加入細胞裂解液提取細胞總蛋白。取30 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，設置電壓為100 V、電泳100 mA。用濕式轉膜裝置將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，電流設置30 mA。室溫下，用封閉緩沖液孵育5 h；然后用E-cadherin(1∶10 000)、N-cadherin(1∶5 000)、GAPDH(1∶2 500)一抗溶液孵育PVDF膜2 h；隨后用二抗溶液與PVDF膜反應1 h。用化學發光試劑盒檢測PVDF膜上的免疫條帶，以Image軟件測得相對灰度值表示目的蛋白表達水平。

1.2.6RT-qPCR檢測Linc00462、miR-2355-5p表達

根據TRIzol試劑說明書提取各組786-0細胞總RNA。利用Prime Script反轉錄試劑盒合成cDNA，再用SYBR Prime Script RT-qPCR試劑盒進行PCR反應。Linc00462正向引物5′-ACT AGG TCC TTC TGG TGT TTT-3′，反向引物5′-GTA AAA CTT GCT GCT GAT G-3′；GAPDH正向引物5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′，反向引物5′-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3′；miR-2355-5p正向引物5′-ATC CCC AGA TAC AAT GGA CAA-3′，反向引物5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；U6正向引物5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,反向引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。采用2-ΔΔCt法計算靶基因表達水平。GAPDH為Linc00462的內參，U6為miR-2355-5p的內參。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗

為確定Linc00462與miR-2355-5p的靶向關系，利用LipofectamineTM 2000將miR-2355-5p mimic或miR-NC分別轉染miR-2355-5p結合位點的Linc00462野生型(wt-Linc00462)及突變型(mut-Linc00462)熒光素酶報告載體。在轉染后48 h利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒分析熒光素酶活性。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 瑞芬太尼對786-0細胞增殖及Linc00462、miR-2355-5p表達的影響

與對照組比較，瑞芬太尼10、20、40 nmol/L組786-0細胞克隆形成數、細胞A值(48 h、72 h)、Linc00462表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-2355-5p表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖1和表1。

A:克隆形成實驗；B：MTT實驗。a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與瑞芬太尼10 nmol/L組比較；c:P<0.05，與瑞芬太尼20 nmol/L組比較。

表1 瑞芬太尼對786-0 Linc00462、miR-2355-5p表達水平和細胞克隆形成的影響

2.2 瑞芬太尼對786-0細胞遷移、侵襲的影響

與對照組比較，瑞芬太尼10、20、40 nmol/L組786-0細胞遷移數、侵襲數、N-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖2和表2。

2.3 沉默Linc00462對786-0細胞增殖、遷移、侵襲的影響

與對照組、si-NC組比較，si-Linc00462組786-0細胞Linc00462表達水平、克隆形成數、侵襲數、遷移數、N-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平、miR-2355-5p表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖3和表3。

A:Transwell實驗；B:Western blot。

A:克隆形成實驗;B:Transwell實驗；C:Western blot。

表2 瑞芬太尼對786-0組遷移、侵襲的影響

2.4 Linc00462能逆轉瑞芬太尼對786-0增殖、遷移、侵襲的影響

與對照組比較，瑞芬太尼組(40 nmol/L)786-0細胞Linc00462表達水平、克隆形成數、侵襲數、遷移數、N-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平、miR-2355-5p表達水平顯著增加(P<0.05)；與對照組比較，pcDNA-Linc00462組786-0細胞Linc00462表達水平、克隆形成數、侵襲數、遷移數、N-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平、miR-2355-5p表達水平顯著降低(P<0.05)；與瑞芬太尼組比較，瑞芬太尼(40 nmol/L)+pcDNA-Linc00462組786-0細胞Linc00462表達水平、克隆形成數、侵襲數、遷移數、N-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達水平、miR-2355-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4和表4。

表3 沉默Linc00462對786-0細胞克隆形成、遷移、侵襲及Linc00462及miR-2355-5p表達的影響

表4 過表達Linc00462逆轉瑞芬太尼對786-0克隆形成、遷移、侵襲的抑制作用

2.5 Linc00462靶向miR-2355-5p

Starbase預測到miR-2355-5p是Linc00462的潛在靶基因，miR-2355-5p與Linc00462之間的預測結合區域見圖5。進行雙熒光素酶報告基因檢測，miR-2355-5p mimics和wt-Linc00462共轉染后相對熒光素酶活性與miR-2355-5p mimics和mut-Linc00462共轉染比較顯著降低(P<0.05)，見表5。

圖5 Starbase預測Linc00462和miR-2355-5p的靶向關系

表5 熒光素酶活性

3 討 論

麻醉是手術治療的重要組成部分，但手術過程中麻醉藥與癌細胞的接觸可能直接影響癌細胞生物學行為，甚至影響癌癥的復發和轉移。因此，探討麻醉藥對RCC細胞生物學行為的影響對臨床治療RCC意義重大。

瑞芬太尼因其起效快、麻醉蘇醒時間快、不良反應發生率低、代謝可預測等優點在臨床腫瘤切術中應用廣泛[8]。LU等[9]研究發現瑞芬太尼對宮頸癌根治術患者的認知功能、T淋巴細胞和炎癥因子的影響相對較小。唐優仕等[10]、趙莉等[11]證實瑞芬太尼在體外能抑制胰腺癌細胞、結腸癌細胞增殖，并促進其凋亡。孟俊青[12]研究表明瑞芬太尼以劑量依賴方式誘導肺癌細胞G2/M期周期阻滯和凋亡。可見，瑞芬太尼對腫瘤細胞生物學行為具有重要影響。本研究以10、20、40 nmol/L瑞芬太尼處理RCC細胞786-0，結果表明786-0細胞活力、克隆能力、遷移和侵襲能力均顯著下降，且呈濃度依賴性，提示瑞芬太尼對RCC細胞惡性表型具有抑制作用。E-cadherin和N-cadherin參與細胞上皮間質轉化(EMT)調控，N-cadherin表達水平上調、E-cadherin表達缺失是腫瘤細胞侵潤、轉移的重要機制，通過調控二者的表達情況可有效調節腫瘤細胞遷移和侵襲行為[13]。本研究中瑞芬太尼處理明顯下調N-cadherin蛋白表達水平，上調E-cadherin蛋白表達水平，這與瑞芬太尼的抗遷移、抗侵襲作用相符和。以上研究表明瑞芬太尼對RCC細胞惡性生物學行為具有抑制作用。

lncRNA通過在轉錄和轉錄后水平調控基因表達，在細胞增殖、分化、凋亡和轉移中具有關鍵作用，與腫瘤發生、轉移關系密切。Linc00462是長度為1 023 nt的lncRNA，胰腺癌中Linc00462表達水平顯著上調，其表達水平與腫瘤大小、腫瘤分化、TNM分期和遠處轉移有關，過表達Linc00462顯著抑制胰腺癌細胞凋亡和黏附，促進胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和細胞周期過程[14]。Linc00462表達水平與肝癌患者生存相關，Linc00462和其他4個lncRNA聯合檢測是肝癌預后的可靠標志物[15]。本研究探討Linc00462在RCC中的功能，結果表明轉染si-Linc00462沉默Linc00462表達可明顯抑制786-0細胞克隆形成、遷移和侵襲能力，抑制N-cadherin蛋白表達，促進E-cadherin蛋白表達，而轉染pcDNA-Linc00462過表達Linc00462則增強786-0細胞克隆形成、遷移和侵襲能力，提示Linc00462在RCC中表現出腫瘤促進功能。同時，本研究發現瑞芬太尼處理后786-0細胞中Linc00462表達水平以劑量依賴方式降低，且瑞芬太尼與沉默Linc00462的抗癌效果類似，提示瑞芬太尼可能通過下調Linc00462在RCC中發揮抗癌功能。深入研究顯示，過表達Linc00462還可明顯削弱瑞芬太尼對786-0細胞克隆形成、遷移和侵襲的抑制作用，并改變N-cadherin和E-cadherin蛋白表達水平。

多項研究證實lncRNA充當miRNA海綿作用是其參與調控腫瘤進展的重要機制，例如lncRNA面生殖發育不良基因5反義RNA1(FGD5-AS1)通過靶向抑制miR-5590-3p促進RCC細胞增殖、遷移、EMT和侵襲[16]。研究表明miR-2355-5p在膀胱癌中表達水平減少，過表達miR-2355-5p能夠抑制膀胱癌細胞惡性表型[17]。miR-2355-5p可作為lncRNA WD重復和FYVE結構域蛋白3反義RNA2(WDFY3-AS2)的靶基因，介導WDFY3-AS2對食管鱗癌細胞增殖、遷移的促進作用[18]。此外，lncRNA受體活性修飾蛋白2-反義RNA(RAMP2-AS1)通過下調miR-2355-5p表達促進血管生成[19]。本研究證實miR-2355-5p是Linc00462的靶基因，且miR-2355-5p的表達受到Linc00462的負性調控。瑞芬太尼處理后miR-2355-5p表達上調，這與沉默Linc00462上調miR-2355-5p表達的作用一致，提示瑞芬太尼可能通過調控Linc00462/miR-2355-5p通路對RCC具有抗癌作用。然而，本研究仍存在不足之處，如敲低或過表達miR-2355-5p對RCC細胞生物學行為的影響仍需驗證。

綜上所述，本研究首次證實瑞芬太尼對RCC細胞的增殖、遷移和侵襲具有抑制作用，其機制可能與下調Linc00462/miR-2355-5p通路有關，這些發現為瑞芬太尼在RCC治療中的應用奠定了理論基礎，為RCC的基因治療提供潛在有效靶點。