干熱環境和噪音刺激對大鼠結腸組織和血清代謝的影響*

卡思木江·阿西木江，湛文博，阿不來提·阿合買提，鐘 麗，希林古麗·吾守爾，庫熱西·玉努斯

(1.新疆醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，烏魯木齊 830017；2.新疆醫科大學第五附屬醫院檢驗科，烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學基礎醫學院機能中心,烏魯木齊830017；4.新疆醫科大學基礎醫學院生物學教研室，烏魯木齊 830017；5.新疆醫科大學維吾爾醫學院，烏魯木齊 830017)

應激是機體對內外環境的各種刺激所產生的一種全身性適應性反應[1]。適度的應激通過機體激素水平的調節、基因表達調控等多種途徑，形成機體對環境的更優越的適應能力[2]。當應激強度超過機體的調節能力，則可造成機體損傷，甚至影響機體的生存[3]。長期的不良生活環境、飲食習慣和惡劣的工作環境是影響人體身心健康的重要因素，并且其與多種疾病有關[4]。如果反復持續性環境刺激未得到及時控制可能成為機體致病的危險因素[5]。中醫認為長期的不良環境和片面性飲食習慣可能通過影響腸道功能引起機體內某些成分水平的變化，進一步導致體質的改變并可能轉變成疾病發生的根源[6]。

疾病發生發展過程中環境和飲食習慣的影響不可忽視。研究發現，濕熱環境對糖尿病、肥胖、高血壓等代謝性疾病可產生一定的影響，并推動疾病的發生發展[7-8]。隨著生物技術的發展，疾病發病和藥物干預機制研究中代謝組學、蛋白組學等系統生物學技術發揮著越來越重要的作用[9-11]。代謝組學是對給定生物或一組生物樣品中所有代謝物的系統鑒定和定量分析的方法，并分析多種生化物種來研究生理調節過程[12-13]。通過使用核磁共振氫譜(1H-NMR)等技術所檢測到的代謝物是體內生理過程中產生的綜合產物，可反映機體的生命狀態。代謝組學檢測能放大基因和蛋白水平上的微小差異并有效減少不表達基因和無活性蛋白的干擾，準確性較高[14]。另外，代謝組學鑒定的新的生物標志物可用于監測和早期發現代謝性疾病的復發[12]。本研究中為了探討環境和飲食習慣對機體的影響，選擇干熱環境、干熱飲食及噪音為應激源刺激Wistar大鼠，通過一般癥狀、結腸組織的病理學、結腸組織超微結構及血清代謝組分變化來分析環境因素、飲食習慣等對大鼠結腸組織和代謝的影響，為預防不良環境對機體的不利影響提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗主要儀器

實驗動物：健康無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠，體重(180±20)g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物質量合格證書號：SCXX[新]2011-0004，本實驗在SPF級實驗室中進行。實驗主要儀器：BS1105型電子天平購自北京賽多科斯天平有限公司、電擊籠購自烏魯木齊啟翔生物科技有限公司、核磁共振波譜儀購自美國Varian公司、重水購自美國Cambridge Isotop Laboratories公司，4 ℃低溫離心機購自德國Eppendarf公司，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、氯化鈉(NaCl)購自天津市光復精細化工研究所，Topspin2.0軟件購自德國Bruker公司，Simca-P軟件購自瑞典Umetrics公司。

1.2 方法

1.2.1實驗大鼠分組

采用隨機數字表法將25只大鼠隨機分為正常組(10只)和實驗組(15只)，每籠5只大鼠，適應性飼養1周后，實驗組大鼠用以下慢性復合刺激法[15-19]連續刺激10 d，(1)干熱藥物：0.3 g西紅花、黑胡椒干粉和干姜干粉各30 g，制成細粉溶于400 mL雙蒸水，制備成50 mg/mL的中藥溶液，每天灌胃1次，每次2 mL。(2)干熱環境：采用人工氣候箱，溫度(26±2)℃，濕度(36%～40%)，每天暴露12 h。(3)干熱性飲水：西紅花1 g溶于400 mL的雙蒸水中，隨機飲水。(4)噪音干預：100 dB的快節奏音樂每天持續播放2 h；正常組大鼠隨機飲食飲水，不進行任何干預。每天定時稱取2組大鼠體重并記錄。

1.2.2實驗取材與處理

1.2.2.1血清標本的收集

干預10 d后所有大鼠禁食24 h，然后用乙醚麻醉，腹主動脈采血，4 ℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清液500 μL，備用。

1.2.2.2結腸標本的收集及處理

用眼科剪沿腸系膜剪開距肛門5～8 cm的結腸，用生理鹽水將結腸內容物沖洗干凈，并快速將結腸分為2部分，0.5 cm×0.5 cm病理組織標本置于10%甲醛溶液，固定12 h后，置于新鮮10%甲醛溶液固定，蘇木素-伊紅(HE)染色進行組織病理學檢查；1 mm×1 mm×2 mm電鏡組織標本置于2.5%戊二醛-磷酸緩沖液中固定(固定液均不少于組織的10倍)12 h后進行電鏡學檢查。

1.2.3核磁共振氫譜(1H-NMR)的記錄

配置血清的緩沖液，以300 mL為例：0.424 g NaH2PO4、2.483 g K2HPO4、2.700 g NaCl充分溶于60 mL重水和240 mL純凈水的溶液中。400 μL的緩沖液中緩慢加入200 μL血清標本，其充分混勻并室溫放置10 min。4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后，取550 μL上清液沿管壁緩慢加入到5 mm核磁管中。用核磁共振波譜儀進行測定。所有血清樣本測試完成后，使用Topspin2.0 軟件做基線矯正、定標。進行積分處理，消除殘留的水信號對分析結果的影響后進行歸一化處理。應用Simca-P軟件進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，并對血清核磁共振掃描(NMR)數據進行模式識別分析。得到相應的OPLS-DA散點(平面和空間)分布圖，并尋找血清中差異代謝組分。

1.2.4標記物的發現與鑒定

通過Pearson相關系數顯著性差異檢測2組大鼠血清中代謝組分水平變化是否具有顯著性的閾值，相關系數絕對值大于顯著性的閾值(顯著性閾值|r|>0.707)，則表示代謝組分有統計學差異(P<0.05)。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠一般狀態

實驗組大鼠干預后出現異常興奮、暴躁、打斗、外部環境刺激敏感性增加、活動量增多等現象；正常組大鼠未出現任何異常。

2.2 定量指標比較

干預前2組間大鼠體重差異無統計學意義(P>0.05);干預后，實驗組大鼠體重較正常組顯著降低(P=0.001)，體重增長率差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

表1 正常組與實驗組大鼠干預前后的體重變化

2.3 組織形態學觀察

HE染色發現實驗組大鼠結腸組織細胞排列紊亂形成濾泡、細胞膜模糊不清、結腸黏膜下層有大量慢性炎癥細胞侵潤；電鏡下發現實驗組大鼠結腸組織細胞發生常染色質增多，線粒體空泡變，杯狀細胞內黏液顆粒較多且排列致密等超微結構改變；正常組大鼠結腸組織則無以上變化。見圖1、2。

2.4 正常組和實驗組大鼠的血清代謝組分分析

1H-NMR圖可以作為化學紋譜用來描述實驗組和正常組大鼠血清中內源代謝組分的變化。結果顯示，在血清1H-NMR圖中發現很多內源性的代謝組分，見圖3。 OPLS-DA二維譜和三維譜結果顯示2組的分布區域完全分開，說明血清代謝組分存在差異。OPLS-DA模型的3個質量參數分別為，R2X=0.72，R2Y=0.98，Q2=0.52。說明該模型對于解釋正常組和實驗組間代謝差異及尋找差異代謝組分是可靠的，見圖4。

A:正常組；B:實驗組。

A:正常組；B:實驗組。

代謝組分在2組中的差異性采用OPLS-DA分析,用獲得的變量重要性指數(variable importance in projection,VIP)值和相關系數P(Corr)值來判斷；VIP>1，P(Corr)>0.707的代謝物為2組中有差異性的代謝組分。與正常組比較，實驗組血清中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、β-羥丁酸及谷氨酰胺等代謝組分的水平升高，而代謝組分低密度脂蛋白(LDL)的水平降低(R2X=0.72,Q2=0.52；R2X代表模型的可解釋變量，R2X值越接近1模型越理想，該值一般應大于0.4；Q2表示模型的預測變量，Q2>0.5表示模型的預測能力較好)，見表2。以上代謝組分主要涉及蛋白合成和分解代謝及血漿脂蛋白代謝。

表2 實驗組血清的主要差異性代謝組分及相關系數

A:正常組;B:實驗組。

A:平面分布;B:空間分布;黑色為正常組，紅色為實驗組。

3 討 論

環境變化會影響機體，當內外環境變化時，機體會通過負反饋應答方式產生特異性和(或)非特異性反應，使機體處于穩態[20]。如果機體內環境穩態被破壞，機體整體平衡被打亂，則會形成亞健康狀態或進一步發展為疾病[21]。本研究發現，干熱環境和噪音刺激的大鼠結腸組織出現細胞排列紊亂、結腸黏膜形成濾泡、細胞膜模糊不清及結腸黏膜下層有大量慢性炎癥細胞侵潤等現象，說明結腸組織存在炎性反應；電鏡結果顯示發生常染色質增多、線粒體空泡變、杯狀細胞內黏液顆粒增多且排列致密等超微結構的改變。線粒體是細胞中產生能量的重要器官,且是對缺氧、微生物毒素等各種損傷較敏感的細胞器[22-23]。文獻報道顯示，黏膜細胞線粒體功能的改變與腸道疾病有關，包括炎癥性腸病(IBD)和結直腸癌(CRC)[24]。本研究中實驗組大鼠受到慢性刺激后線粒體表現為數量、大小和結構(腫脹)的改變，甚至可轉化為空泡狀結構，說明干熱環境和噪音刺激導致結腸組織的病理性損傷，導致大鼠腸道能量供應不足，引起大鼠體重增長速度降低。杯狀細胞的主要功能是分泌含有黏蛋白的、對結腸上皮起保護作用的黏性顆粒，當細菌直接侵入腸壁組織內時杯狀細胞分泌大量黏性顆粒。黏性顆粒的增多進一步驗證結腸組織存在炎性反應，說明干熱環境和噪音刺激的共同干預可能誘發腸道炎癥性疾病的發生。本研究1H-NMR代謝組學結果顯示，與正常組比較，實驗組大鼠血清中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、肌酸、苯丙氨酸、檸檬酸、乙酰乙酸、β-羥丁酸及谷氨酰胺等代謝組分的水平升高，其中5種代謝物差異有統計學意義(P<0.05)，而代謝組分LDL水平降低。異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸是必需氨基酸，機體不能自身合成。此類氨基酸在血清中水平升高，極有可能是應激導致體內蛋白(主要是肌肉蛋白)的分解速度加快的結果[25]，其可能為實驗組大鼠體重增長緩慢的原因之一。異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸是支鏈氨基酸，具有抗疲勞作用[26]，其水平在血清中升高，導致與中樞疲勞有關的神經遞質5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素水平下降[27-28]，使大腦興奮性增加，減少睡眠使精神活躍。可以推測干熱環境和噪音刺激使大鼠處于異常興奮狀態，與本研究中實驗組大鼠出現暴躁、打斗等現象吻合。

血清中的乙酰乙酸和β-羥丁酸既是酮體的主要形式，又是煙酰腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化呼吸鏈的底物，其水平增高，通過底物水平磷酸化和氧化磷酸化加速三羧酸循環。亮氨酸、苯丙氨酸既可作為酮體合成的原料，促進酮體的產生，又可促進酮體的分解利用，血清中水平增高。支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)通過糖異生和生成酮體的方式參與機體的供能。苯丙氨酸是合成腎上腺素的原料，其水平升高，引起細胞內cAMP水平升高，使低活性的磷酸化酶b向高活性的磷酸化酶a轉換，使肌糖原的分解速率增高。肌酸主要由骨骼肌細胞攝取，在線粒體中可以轉變為磷酸肌酸并儲存ATP的高能磷酸鍵，是能量儲存和利用的重要化合物[29-30]。為了滿足機體需要，磷酸肌酸到達肌原纖維后，迅速補充ATP的水平。血清中肌酸水平升高進一步說明機體利用磷酸肌酸產生ATP的量增多。

谷氨酰胺是為小腸提供主要的能源物質，促進小腸黏膜等上皮細胞生長、分化和增殖，尤其在應激和高代謝狀態時，谷氨酰胺的需求量顯著增加[31]。本研究中，谷氨酰胺在血清中水平升高，可能存在2種情況：(1)體內蛋白分解速度加快，氨基酸通過聯合脫氨基作用生成NH3，而谷氨酰胺是氨在血中的運輸載體，其水平必然升高；(2)腸道是利用谷氨酰胺的主要器官，若其功能異常則消耗的谷氨酰胺量就減少，由于機體的應激反應造成其在血清中水平升高；谷氨酰胺在血清中水平升高，說明腸道功能出現異常，進一步解釋了干熱環境和噪音刺激的共同干預可能為潰瘍性結腸炎等非特異性炎癥性疾病的原因。

LDL是由血液中的極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)轉變而來，是體內轉運膽固醇的載體，其所運輸的膽固醇可以轉化成膽汁酸進入到腸道幫助脂類的消化吸收。脂蛋白的解毒作用可防止內毒素引發的炎性反應[32]，本研究中UC組大鼠血漿中LDL水平降低，此可能是全身逐漸開始出現炎性反應的一種表現。

在干熱環境中采取干熱藥物灌胃、干熱性飲水及各種慢性刺激可導致亞健康狀態的產生，使體內糖、脂、蛋白代謝紊亂，三大營養物質的分解代謝速度加快，ATP增多，但仍不能滿足機體的需要，因此機體動員儲存能量，大鼠處于高產能、高耗能及代謝紊亂的高亢奮狀態并導致機體內環境穩態改變，使機體對疾病的易感性增高。總之，干熱環境和噪音等慢性刺激的延長會導致代謝紊亂，可能為導致代謝性疾病的發生的危險因素。