Akt、mTOR和PD-L1表達與肺癌臨床病理特征的相關性

胡祥坤 潘春香 孫如坤 王艷杰 鹿 敏

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中約85%以上為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，目前臨床治療方式有手術、化療、放療等，而對晚期NSCLC患者來說這些方式的效果均有限[1]。而近年來免疫療法取得了長足的進展，程序性死亡配體-1(programmed death 1，PD-1)/程序性死亡受體配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)通路能夠抑制T細胞活化，從而使腫瘤細胞逃離免疫系統監視[2]。而PD-1、PD-L1靶點抑制劑能夠消滅腫瘤，這為臨床開辟了一種新的治療選擇，在黑色素瘤、肺癌等疾病治療過程中取得顯著效果[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又稱AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路對腫瘤細胞血管生成、細胞增殖等具有一定的調控作用[4]。近來發現AKT、mTOR可能是治療肺癌的有效靶分子，但具體作用機制尚未完全清楚[5]。因此，本研究旨在探討Akt、mTOR和PD-L1表達與肺癌患者臨床病理特征的相關性，為進一步應用應用針對Akt、mTOR和PD-L1的免疫治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年5月至2016年5月來我院就診的肺癌患者96例，納入標準：①經影像學及病理學結果確診為NSCLC；②手術方式為R0切除；③患者臨床資料完整；④預計生存時間>3個月以上。排除標準：①伴有其他惡性腫瘤患者；②伴有心臟、腎臟等重要器官功能障礙患者；③入組前4個月行抗腫瘤治療；④妊娠或哺乳期婦女。本研究經醫學倫理委員會同意。

1.2 方法

樣本收集：取患者癌組織及癌旁組織，標本固定及包埋等處理按照我院病理科常規，經HE染色后再顯微鏡下觀察，并根據2004版世界衛生組織肺癌組織學分類標準評估腫瘤標本組織學分級。免疫組化：采用SP法，石蠟切片用常規二甲苯脫蠟，梯度無水乙醇進行水化，將其置于3%的H2O2溶液中浸泡，PBS緩沖液清洗切片，共3次，加入正常山羊血清進行封閉20 min，加入兔抗人Akt、mTOR(按照1∶200稀釋，購自美國CST公司)和PD-L1抗體(按照1∶200稀釋，購自英國Abcam公司)多克隆抗體，37℃下孵育1 h，TBST沖洗2次。加入鼠兔通用二抗，37℃下孵育1 h，PBS沖洗2次，再加入DAB顯色、蘇木精復染、梯度酒精分化，并進行風干及封片，于顯微鏡下觀察。染色用PBS液代替一抗作陰性對照，已知陽性染片做陽性對照。結果判定：參考文獻[6]，PD-L1在腫瘤細胞以及癌間質細胞中均有表達，主要定位于細胞膜，切片染色為淡黃色至棕褐色，染色強度得分：無染色：0分，淡黃色：1分，棕黃色：2分，棕褐色：3分；陽性細胞百分比得分：無陽性細胞記0分，陽性細胞<25%記為1分，陽性細胞數在25%～50%記為2分，陽性細胞數>50%記為3分；總分為染色強度得分×陽性細胞百分比得分；分數≤2分記為陰性；分數>2分記為陽性。Akt在細胞核及細胞質中均有表達，mTOR主要表達于細胞質，染色強度評分如下：無染色：0分，淡黃色：1分，棕黃色：2分，棕褐色：3分；染色面積評分如下：0分為無細胞染色，染色面積<10%記為1分，染色面積10%～50%記為2分，染色面積50%～75%為3分，染色面積>75%為4分。以染色強度及面積的評分相加為最后得分，0～2分為陰性，3分及以上為陽性。

1.3 觀察指標

所有患者入院后收集其一般資料，性別、年齡、病理類型、腫瘤部位、TNM分期、腫瘤大小、分化程度、淋巴是否轉移。以電話及門診形式對所有患者進行隨訪，隨訪內容包括：患者病情進展、影像學檢查，記錄患者生存情況，在第1年每3個月隨訪1次，第2～5年，每6個月隨訪1次，隨訪截止時間2021年5月。

1.4 統計學方法

應用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗進行，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1表達與NSCLC臨床病理特征的關系

PD-L1主要在肺癌細胞及癌間質細胞中表達，96例患者癌細胞中PD-L1陽性率為58.33%，癌間質細胞中陽性表達率為63.54%。PD-L1表達與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、淋巴結轉移無關(P>0.05)，見表1。

表1 PD-L1表達與 NSCLC臨床病理特征的關系/例

2.2 Akt、mTOR表達與NSCLC臨床病理特征的關系

Akt在細胞核及細胞質中均有表達，mTOR主要在細胞質中表達，Akt及mTOR陽性表達率分別為60.42%、62.50%。Akt表達與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、病理類型、腫瘤部位無關(P>0.05)。mTOR表達與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、淋巴結轉移無關(P>0.05)，見表2。

表2 Akt、mTOR表達與NSCLC臨床病理特征的關系/例

2.3 PD-L1與Akt、mTOR的關系

PD-L1在Akt陽性組中的表達率高于Akt陰性組，差異有統計學意義(P<0.05)，PD-L1在mTOR陽性組中的表達率高于mTOR陰性組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 PD-L1和Akt、mTOR的關系/例

2.4 Akt、mTOR和PD-L1的表達對患者總生存期的影響

隨訪5年，存活45例，總生存率為46.88%，PD-L1陰性組5年生存率為60.00%(24/40)，高于PD-L1陽性組的37.50%(21/56)(P<0.05)，Akt陰性組5年生存率為65.79%(25/38)，高于Akt陽性組的34.48%(20/58)(P<0.05)，mTOR陰性組5年生存率為72.22%(26/36)，高于mTOR陽性組的31.67%(19/60)(P<0.05)，見圖1。

圖1 PD-L1、Akt和mTOR的表達對患者總生存期的影響

3 討論

肺癌是世界發病率及死亡率最高的癌癥，NSCLC其常見類型，包括鱗狀細胞癌、腺癌及大細胞癌，大部分NSCLC患者確診時已為晚期，不能進行手術治療，患者預后較差，因而探索NSCLC的發生機制和新的治療方式顯得尤為重要[7]。NSCLC的發展過程是多基因、多因素共同參與的結果，隨著人們對腫瘤細胞免疫逃逸機制的深入了解，免疫治療已成為目前的研究熱點。

PD-1是CD28家族的成員之一，在人體內PD-1蛋白主要表達于腫瘤組織的T淋巴細胞及相關淋巴細胞[8]。PD-L1是一種協同信號分子，又稱B7-H1，作為PD-1的主要配體，其已被證實廣泛表達于多種腫瘤細胞表面[9]。正常情況下PD-1與PD-L1結合，通過調節T細胞與抗原提呈細胞或T細胞與靶細胞接觸時間，介導免疫逃逸，從而導致腫瘤發生及發展[10]。研究表明[11]PD-1/PD-L1通路是腫瘤微環境中重要的“哨卡點”，其表達可能與腎癌、肺癌的臨床病理特征及不良預后相關。還有研究表明[12]PD-1/PD-L1通路可作為肺癌個體化治療的有效治療靶點。本研究中，PD-L1主要在肺癌細胞及癌間質細胞中表達，96例患者癌細胞中PD-L1的陽性率為58.33%，癌間質細胞中陽性表達率為63.54%。而進一步研究PD-L1的表達與NSCLC患者臨床病理特征發現，PD-L1的表達與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關。腫瘤部位存在差異，這可能與左、右肺部微環境存在一定差異相關[13]。而對于TNM晚期及分化程度較低患者，其PD-L1陽性表達率較高，這可能是PD-L1的陽性表達使得免疫細胞無法有效清除腫瘤細胞相關，使疾病進一步發展[14]。隨訪5年，PD-L1陰性組的5年生存率為60.00%，高于PD-L1陽性組的37.50%(P<0.05)，提示PD-L1陰性是預后較好的指標。

研究發現，約90%的NSCLC細胞株存在PI3K/AKT/MTOR通路的激活[15]。PI3K屬于磷脂激酶家族，Akt是一種原癌基因，通過磷酸化多種轉錄因子，控制細胞的凋亡、侵襲及血管生成等過程。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，是Akt的下游分子，從酵母到哺乳動物均廣泛存在，能調節細胞的各過程，包括蛋白質合成、生長、代謝等，在子宮內膜癌、乳腺癌、胰腺癌中均發現mTOR表達水平異常升高。研究[16]表明PI3K/AKT/mTOR通路將有絲分裂信號傳遞給p70s6k，使細胞周期蛋白和CDK4表達上調，導致蛋白p21Cip1/WAF1和p27Kip1表達下調，促使細胞從G1期向S期進展。本研究中，Akt在細胞核及細胞質中均有表達，mTOR主要在細胞質中表達，Akt及mTOR陽性表達率分別為60.42%、62.50%，與既往結果相一致。本研究發現，Akt的表達與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、分化程度相關，mTOR的表達與腫瘤部位、TNM分期、分化程度相關。隨訪5年，發現Akt陰性組的5年生存率為65.79%，高于Akt陽性組的34.48%，mTOR陰性組的5年生存率為72.22%，高于mTOR陽性組的31.67%。由此可見Akt及mTOR與患者的臨床病理特征及預后存在一定關系。

同時進一步研究發現，PD-L1在Akt陽性組中的表達率高于Akt陰性組，同時PD-L1在mTOR陽性組中的表達率高于mTOR陰性組，這提示PD-L1的表達與Akt、mTOR的表達均在一定聯系。有研究發現[17]，PI3K/AKT/mTOR通路可影響腫瘤微環境內免疫細胞的活性及PD-1與PD-L1表達，參與免疫抑制微環境的形成，阻斷PI3K/AKT/mTOR通路，恢復患者機體的免疫應答，增強抗腫瘤固有的免疫效應。當然本研究還存在一定不足，關于PD-L1、Akt、mTOR與患者預后關系仍需擴大大樣本，并進行前瞻性、隨機對照試驗加以證實。

綜上，Akt、mTOR和PD-L1過表達與NSCLC患者臨床病理特征存在一定關系，對患者的預后判斷起著重要的指導作用，為臨床治療提供新的思路。