泰山磐石散對流產模型大鼠血清性激素水平的影響

冉添福，劉小倩，楊 繪，江 澍

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

中醫學對自然流產（spontaneous abortion，SA）的研究源遠流長，從《金匱要略》到《諸病源候論》，再到《景岳全書·婦人規》等，均對此病有所記載［1］。現代醫學認為，SA的定義是在妊娠28周前，未使用人工方法而發生的妊娠終止［2］。SA的病因除了生殖道異常、胎兒染色體異常、免疫因素及感染因素外，內分泌異常特別是性激素水平的改變也被認為是SA的常見病因［3］。正常的妊娠過程不僅需要發育良好的子宮環境，也需要各種激素相互協調共同促進胚胎發育生長。在妊娠期間，內分泌的異常會導致諸多妊娠相關疾病，例如黃體功能不全、高泌乳素血癥、多囊卵巢綜合征等［4］。本課題組前期研究發現泰山磐石散能夠提高孕激素的表達水平，從而起到抑制免疫和抗炎的作用，達到降低流產發生率的目的［5］。本研究在前期研究基礎上，進一步探討泰山磐石散在治療自然流產時黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、泌乳素（prolactin，PRL）、睪酮（testosterone，T）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）等性激素對妊娠的影響作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級10周齡雄性SD大鼠15只，9周齡雌性SD大鼠15只，體質量（240±20）g，購于福建中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2019-0002。飼養于福建中醫藥大學SPF級實驗動物中心，自由飲水攝食，溫度（24±2）℃，濕度為40%～60%，每天12 h明暗環境交替。

1.2 實驗藥物 溴隱亭（福州博涵生物公司），取2.5 mg溴隱亭溶于75%乙醇，配制成濃度為0.3 mg/mL的溴隱亭混懸液，4℃避光保存，1周以內使用。泰山磐石散藥物組成：人參9 g，黃芪9 g，白術4.5 g，炙甘草4.5 g，當歸9 g，川芎7.2 g，白芍7.2 g，熟地黃7.2 g，川續斷9 g，黃芩9 g，砂仁4.5 g，糯米18 g，購自福建中醫藥大學附屬人民醫院。將所有藥物混合（除砂仁外），加入適量純水，浸泡1 h，將砂仁研磨成粉末備用，大火煮沸，然后文火再煮25 min，加入砂仁粉末繼續煎煮5 min，過濾2次得藥液；在藥渣中再加入適量純水，重復以上操作1次；將2次藥液混合，濃縮至120 mL，制成含生藥量1 g/mL的藥液，4℃保存。

1.3 實驗試劑和儀器 LH、PRL、T、FSH的ELISA試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；酶標儀（澳大利亞GmbH公司）；電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；水平離心機（上海安亭科學儀器廠）；恒溫水浴鍋（蘇州凈化設備有限公司）；超純水機（四川優普超純科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組 將SD大鼠適應性喂養14 d，期間對雌性SD大鼠進行數次稱重，觀察體質量是否達到配種標準，待雌鼠體質量達到配種要求后，將15只雌鼠和15只雄鼠按1∶1比例合籠過夜配種，并將15只雌鼠隨機分為正常對照組、模型組、泰山磐石散組各5只，配種后次日開始，每日7時觀察雌性大鼠排泄物中有無陰道栓脫落。當觀察到雌鼠有陰道栓脫落時視為妊娠第1天，并分別每天記錄孕鼠體質量。

2.2 干預 正常對照組孕鼠從受孕第1天至取材前1天（共12 d）灌服生理鹽水，從受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射75%乙醇溶液，連續注射3 d；模型組孕鼠從受孕第1天至取材前1天（共12 d）灌服生理鹽水，從受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射溴隱亭，連續注射3 d；泰山磐石散組孕鼠從受孕第1天至取材前1天（共12 d）按2.49 g/（kg·d）予泰山磐石散藥液灌胃，從受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射溴隱亭，連續注射3 d。

2.3 取材 于大鼠妊娠的第12天取材（禁食不禁水12 h），進行稱重，腹腔注射8%的乳化異氟烷（0.51～0.64 mL/kg）麻醉孕鼠，待孕鼠完全麻醉后，迅速解剖，打開腹腔，觀察妊娠情況，取腹主動脈采集外周血，外周血室溫靜置2～3 h，待血液凝固血塊收縮后，4℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，分裝，置于-80℃冰箱中保存。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清中LH、PRL、T、FSH的表達 將4℃存放的試劑盒放置室溫平衡30 min，嚴格按照說明書提示進行操作，于15 min內按照說明書的要求，在酶標儀選擇合適的波長測量各孔的吸光度（OD值）。以標準的濃度作為橫坐標，測出的OD值作為縱坐標，作出標準曲線，計算樣品濃度。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件對實驗數據進行分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組內比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊采LSD法分析，方差不齊采用Games-Howell法分析；不符合正態性檢驗者，采用非參數分析。

3 結果

3.1 3組大鼠血清中LH、PRL、T、FSH表達水平比較 與正常對照組比較，模型組孕鼠血清中LH、PRL、T和FSH濃度均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，泰山磐石散組孕鼠血清中LH、T和FSH濃度明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠血清中LH、PRL、T、FSH濃度比較（±s）

表1 3組大鼠血清中LH、PRL、T、FSH濃度比較（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常對照組模型組泰山磐石散組n555 LH/（ng/L）47.86±2.66 56.85±2.631）49.57±3.082）PRL/（pg/mL）167.31±10.01 214.33±8.741）214.15±9.001）T/（nmol/L）84.44±3.77 102.88±5.791）95.33±5.952）FSH/（IU/L）26.58±1.39 30.60±1.001）28.04±1.422）

3.2 3組大鼠胚胎情況比較 與正常對照組比較，模型組大鼠子宮內瘀血嚴重，胚胎顏色呈黑紫色，部分胚胎體積明顯減小，胚胎吸收率明顯增高（P＜0.05）；與模型組比較，泰山磐石散組大鼠子宮內狀態明顯好轉，接近于正常對照組大鼠，胚胎呈淡粉色或紅色，胚胎吸收率明顯降低（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 3組大鼠胚胎吸收率比較（±s）

表2 3組大鼠胚胎吸收率比較（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常對照組模型組泰山磐石散組n 555胚胎總數/個107 92 98胚胎吸收數/個9 31 19吸收率/%8.29±0.03 35.23±0.091）19.31±0.032）

圖1 3組大鼠胚胎妊娠情況

4 討論

自然流產是一個極其復雜的疾病，甚至可以稱之為疑難雜癥，對女性及其家庭的傷害是巨大且無可挽回的，其致病原因眾多［6］，且半數以上的病因仍無法明確。內分泌異常是SA的常見病因，內分泌特別是性激素水平對胚胎發育的影響是巨大的，內分泌異常最終會導致妊娠失敗［7］，所以在孕前檢查通常會檢測性激素水平，可檢測是否存在黃體功能不全、高泌乳素血癥和多囊卵巢綜合征等情況，本實驗通過檢測流產模型孕鼠血清中的部分性激素（LH、PRL、T、FSH），探究泰山磐石散在治療SA過程中對性激素的調控作用。

LH又稱為促黃體生成素，是由垂體前葉分泌的激素，能夠刺激卵巢分泌雌激素，并對睪酮的分泌有促進和刺激作用。一般在女性的月經期，體內的LH濃度會呈上升趨勢，在某一點到達高峰后迅速下降。LH過高會引起一系列妊娠相關疾病，例如原發性性功能減退癥、卵巢功能衰竭等，嚴重的就會導致不孕或妊娠失敗［8］，但黃體生成素增多導致流產的作用機制一直未能明確，有相關報道稱可能是因為改變了卵泡的生存環境從而造成卵母細胞早熟有關［9］。本研究發現用溴隱亭所造大鼠流產模型的LH值升高，使用中藥泰山磐石散可降低孕鼠體內LH，最終改善大鼠妊娠狀態，發揮良好的安胎作用。

PRL又稱為催乳素，由垂體前葉腺嗜酸性細胞分泌，有促進乳腺發育生長和泌乳的作用，還可刺激卵泡LH受體生成。有研究表明，小劑量的PRL對卵巢激素與孕激素的合成有促進作用，而大劑量的PRL則會產生抑制作用，從而使受精和胚胎發育受阻，最終導致不孕和妊娠失敗［10-11］。本實驗證明大鼠流產模型體內的PRL含量顯著升高，而泰山磐石散可以降低泌乳素的表達水平，妊娠結局良好。

T除了由睪丸分泌還可以由腎上腺皮質和卵巢合成，女性釋放在血中的睪酮主要來自于腎上腺皮質。正常情況下，女性體內的睪酮和雌激素水平是保持平衡的，如果雄激素過多，則容易導致高雄激素血癥，該病主要在卵巢和腎上腺發生，主要特點是多毛、不孕、多囊卵巢綜合征和卵巢腫瘤等，有研究顯示約1/5的流產患者患有高雄激素血癥［12］，高雄激素作為雌激素的拮抗劑，會通過作用于卵母細胞，導致卵泡發育障礙，最終引發不孕和流產［13］。女性體內過多的雄激素會抑制下丘腦分泌促性腺激素釋放激素，影響子宮內膜的增生，并影響胚胎的著床或發育［14］。本次實驗進一步研究證明大鼠流產模型體內的睪酮水平明顯升高，使用泰山磐石散可以降低睪酮的表達水平，更好地維持妊娠，使胚胎能夠正常著床、發育。

FSH以糖蛋白為主要成分，作用主要為促進卵泡成熟，主要由垂體前葉嗜堿性細胞分泌。對于女性而言，LH聯合FSH對卵泡成熟，生成雌激素、排卵，黃體的產生與維持，孕激素的生成均有促進作用［15］。妊娠期間，隨著卵泡的發育，雌激素分泌增加，加上抑制素的作用，卵泡生長對FSH的依賴性降低，故FSH水平也隨之降低［8］。本實驗研究證明大鼠流產模型體內的FSH水平相比正常對照組升高，使用泰山磐石散可以降低FSH的表達水平，改善流產情況。

綜上所述，泰山磐石散主要通過降低母體血清中LH、T、FSH等性激素的表達水平，改善了母體的內分泌水平，從而保證了胎兒的正常發育，最終達到降低流產風險，改善妊娠結局的作用。但在研究泰山磐石散對流產模型大鼠血清中PRL表達的影響中發現：模型組大鼠血清中PRL的表達與正常組比較明顯升高（P＜0.05），但與泰山磐石散組差異無統計學意義（P＞0.05）。因此本實驗后續擬增加樣本量，并用其他實驗方法繼續探討泰山磐石散對流產模型大鼠血清中PRL的影響。