雌孕激素聯(lián)合對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠口腔潰瘍的治療作用

胡佳敏，宋兆俠，陳銘悅，陳永吉，紀(jì) 悅，楊如會(huì)*

（1.麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.麗水市婦幼保健院孕產(chǎn)保健科，浙江 麗水 323000）

口腔潰瘍，是指口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，常呈圓形或卵圓形，直徑在1mm 至10 mm 之間，潰瘍周圍充血，主要發(fā)生在頰、唇、舌緣等部位，疼痛明顯，是口腔黏膜最常見的疾病。口腔潰瘍，特別是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍，常反復(fù)發(fā)作、久治不愈，給患者的工作和生活帶來很大影響和痛苦[1]。目前，治療口腔潰瘍以藥物治療為主，但效果仍不夠理想。

口腔潰瘍女性發(fā)病率比較高，男女發(fā)病比例為1∶2.7[2]，特別是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（Recurrent Oral Ulcer），與性激素水平有密切聯(lián)系，口腔潰瘍常在女性月經(jīng)前和月經(jīng)期反復(fù)發(fā)作，而在月經(jīng)后期、妊娠期和哺乳期癥狀消失或好轉(zhuǎn)，被認(rèn)為與月經(jīng)周期內(nèi)性激素水平的變化有關(guān)[3-4]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：女性口腔潰瘍患者中的黃體期雌二醇、孕酮明顯低于正常組[5-6]。月經(jīng)期相關(guān)口腔潰瘍患者黃體期孕酮和催乳素水平異常（催乳素升高導(dǎo)致孕酮分泌減少），在兩者的作用下引起機(jī)體免疫功能失調(diào)，從而引起口腔潰瘍周期性反復(fù)發(fā)作[7]。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)口腔黏膜存在雌激素和孕激素受體分布，雌激素和孕激素刺激均可以促進(jìn)黏膜修復(fù)[4，8]。為此，本研究擬通過雌激素聯(lián)合孕激素對(duì)大鼠口腔潰瘍模型進(jìn)行干預(yù)，觀察是否可以促進(jìn)口腔潰瘍的愈合，并對(duì)口腔潰瘍的發(fā)病機(jī)制作一探討。

1 材料與方法

1.1 材 料

雌激素（雌二醇）注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H31021114）；孕激素（黃體酮）注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：151205）；成年SD 雌性大鼠40 只，體重220±20 g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005）；Masson 染色試劑盒（Solarbio，G1345）；HE 染色試劑盒（南京建 成 生 物 工 程 研 究 所，D006-1-1）；TGF-β1 antibody，（abcam，ab190503）；Keratin 5 antibody（abcam，ab64081）；定量PCR 檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物公司，Q411-02）；總RNA 提取試劑盒（上海捷瑞生物工程公司，GK3016）；RT SuperMix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物公司，貨號(hào)R222-01）；游標(biāo)卡尺（晶思達(dá)，JSD-KC）；PCR 基因擴(kuò)增儀（BIO-RAD，CFX Connect Real-Time System）；顯微鏡（OLYMPUS，BX43）。

1.2 動(dòng)物分組

成年雌性大鼠40 只，按體重隨機(jī)分為4 組，模型對(duì)照組、雌激素組（0.5 mg/mL）、孕激素組（1 mg/mL），雌激素+孕激素組。每組10 只，屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，相對(duì)濕度60%～80%，溫度22～26 ℃，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.3 模型復(fù)制方法和干預(yù)

參考文獻(xiàn)［9］，采用改良手術(shù)方法復(fù)制大鼠口腔潰瘍模型。分別以10%水合氯醛（3 mL／kg）腹腔注射麻醉后固定于操作臺(tái)上，用無菌棉球干燥SD 大鼠唇側(cè)黏膜，并用無菌棉球隔濕，將3 mm×3 mm 的NaOH 晶體置于唇側(cè)黏膜，維持30 s 后取下NaOH 晶體，用含生理鹽水的無菌棉球蘸拭處理部位，去除殘余NaOH，觀察記錄處理部位即刻反應(yīng)。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后48 h，觀察記錄潰瘍形成情況，包括形成潰瘍的出現(xiàn)率、潰瘍變化、外形是否均一規(guī)則，潰瘍?yōu)橹醒氚枷荨⒓倌じ采w、邊緣紅腫、刺激疼痛反應(yīng)強(qiáng)烈為模型復(fù)制成功。愈合標(biāo)準(zhǔn)為黏膜上潰瘍消失。

模型復(fù)制成功后，按組別設(shè)計(jì)分別進(jìn)行藥物干預(yù)：大鼠頭部固定后，每日早晚兩次，以吸管吸取藥液（生理鹽水稀釋）滴在潰瘍創(chuàng)面2 滴/次，模型組用生理鹽水代替，持續(xù)10 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 口腔潰瘍大小測(cè)量

每2 d 測(cè)量1 次，記錄口腔潰瘍變化情況并記錄炎癥、出血等改變，根據(jù)潰瘍愈合組織改變繪制潰瘍面積曲線和潰瘍愈合率。

1.4.2 病理HE 染色和Masson 染色

第10 d 末，取口腔黏膜病變部位，10%福爾馬林溶液固定后，梯度酒精脫水、石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下觀察黏膜病理改變。按Masson 染色試劑盒方法進(jìn)行Masson 染色，觀察膠原纖維改變。

1.4.3 組織TGF-β1、Keratin 5 免疫組化染色

免疫組化采用過氧化物酶標(biāo)記法進(jìn)行TGF-β1、Keratin 5 染色。石蠟切片行二甲苯梯度脫蠟，梯度酒精脫水，磷酸鹽緩沖液洗3×3 min，3%H2O237 ℃孵育15 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中水煮10 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，轉(zhuǎn)至室溫平衡30 min，磷酸鹽沖洗后滴加二抗，37 ℃孵育30 min 后DAB 反應(yīng)染色，蘇木素復(fù)染，封片拍照。免疫組化評(píng)分采用半定量分析方法。以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比進(jìn)行評(píng)分，染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度并減去背景著色計(jì)分：無明顯著色為0 分，輕微為1 分，中度為2 分，重度為3 分。陽性細(xì)胞百分比：0%～5%評(píng)為0分，6%～25%評(píng)為1 分，26%～50%評(píng)為2 分，51%～75%評(píng)為3 分，＞75%均評(píng)為4 分。最終評(píng)分以陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度的加和為準(zhǔn)：0 分為陰性，3 分為弱陽性，4～5 分為中度陽性，6～7 分為強(qiáng)陽性[10]。

1.4.4 Real-Time PCR 檢測(cè)TGF-β1、Keratin 5 基因表達(dá)

取部分黏膜組織，液氮速凍后碾碎，使用Trizol 試劑（Invitrogen，U.S.A）提取組織總RNA，使用MMLV-reverse transcriptase 將其轉(zhuǎn)化為cDNA[11]。用TGF-β1、Keratin 5 引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過將閾值周期（Ct）值歸一化，使用計(jì)算公式2-ΔΔCt計(jì)算出每個(gè)樣本中TGF-β1、Keratin 5 的相對(duì)mRNA 量。引物序列：TGF-β1 Sense primer:′-CACCATCCATGACATGAACC-3′，Anti-sense primer:5′-TCATGTTGGACAAC TGCTC-3′；Keratin 5 Sense primer:5′ -AGG GCACCAAGACCATAAAGCA-3′，Anti-sense primer: 5′ -TTCATGTAGGCCGCGT CCAC-3′；GAPDH Sense primer: 5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，Anti-sense: primer: 5′-AGATCCACAACGG ATACATT-3′。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以mean±S.D.表示，差異性分析采用t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為顯著差異，P＜0.01 為極顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 雌激素聯(lián)合孕激素促進(jìn)大鼠口腔潰瘍愈合

模型復(fù)制第二天后，顯示口腔黏膜局部出現(xiàn)潰瘍，潰瘍直徑4～5 mm，周圍充血紅腫明顯，邊緣整齊，表面有灰黃色假膜覆蓋（圖1.A）。雌激素和孕激素干預(yù)組分別用雌二醇（0.5 mg/mL）和黃體酮（1mg/mL）每天兩次局部干預(yù)潰瘍部位，10 d 后，潰瘍面積和潰瘍愈合率的結(jié)果顯示，雌二醇和黃體酮干預(yù)組口腔潰瘍愈合加快（相對(duì)于模型組，P＜0.05），相對(duì)于單獨(dú)給藥干預(yù)組，聯(lián)合干預(yù)具有良好的協(xié)同作用（相較于單獨(dú)干預(yù)組，P＜0.05 或0.01）（圖1.B- C）。

圖1 大鼠口腔潰瘍的復(fù)制和雌激素聯(lián)合孕激素的干預(yù)增加潰瘍愈合

2.2 雌激素聯(lián)合孕激素促進(jìn)潰瘍模型纖維組織增加

為進(jìn)一步分析雌激素和孕激素干預(yù)后對(duì)口腔潰瘍模型病理的改變，運(yùn)用HE 染色和Masson 染色分析病理和膠原的變化。HE 結(jié)果顯示：模型組口腔黏膜表面完整性受損、表皮和角化層變化不明顯、皮下組織變薄、炎細(xì)胞浸潤、部分區(qū)域肌肉層顯露；Masson 染色顯示潰瘍組織膠原纖維稀疏、紊亂。雌激素和孕激素干預(yù)后可以明顯促進(jìn)潰瘍組織愈合，皮下組織增加，表皮和角化層增加，皮下膠原增加，炎細(xì)胞浸潤減少，而聯(lián)合給藥明顯強(qiáng)于單獨(dú)給藥組（圖2）。

2.3 雌激素聯(lián)合孕激素增加口腔潰瘍組織TGF-β1、Keratin 5 的蛋白和基因表達(dá)

為進(jìn)一步分析雌激素和孕激素對(duì)口腔潰瘍組織的作用機(jī)制，通過免疫組化檢測(cè)TGF-β1、Keratin 5蛋白改變，運(yùn)用RT-PCR 檢測(cè)其mRNA 改變。免疫結(jié)果顯示：模型組口腔黏膜的TGF-β1、Keratin 5 蛋白表達(dá)較低，雌激素聯(lián)合孕激素干預(yù)的皮下組織的TGF-β1、Keratin 5 蛋白表達(dá)明顯增加（與模型組比較，P＜0.01），而雌激素和孕激素單獨(dú)干預(yù)則不明顯（圖3）。為進(jìn)一步研究作用機(jī)制，運(yùn)用RT-PCR 去檢驗(yàn)口腔黏膜組織的TGF-β1、Keratin 5 的mRNA 表達(dá)。溶解曲線結(jié)果顯示，基因擴(kuò)增產(chǎn)物正常，基因擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示模型組TGF-β1、Keratin 5 的mRNA 表達(dá)降低，而雌激素和孕激素聯(lián)合干預(yù)可以增加mRNA 的表達(dá)，而單獨(dú)處理組不明顯（與模型組和單獨(dú)處理組比較，P＜0.01）（圖4）。

圖3 大鼠口腔潰瘍組織TGF-β1、Keratin 5 免疫組化染色

圖4 大鼠口腔潰瘍組織TGF-β1、Keratin 5 mRNA 表達(dá)

3 討 論

口腔潰瘍誘發(fā)的原因比較復(fù)雜，如機(jī)械性刺激、化學(xué)性灼傷、熱冷刺激、遺傳因素、免疫和精神因素等。有研究顯示，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍與內(nèi)分泌有關(guān)，部分女性患者口瘡發(fā)作與月經(jīng)周期有關(guān)，說明雌孕激素的水平或受體與口腔潰瘍的發(fā)病有關(guān)[12]。

雌激素能夠刺激陰道上皮細(xì)胞分化和角質(zhì)化，增加上皮細(xì)胞內(nèi)的糖原及糖原分解；孕激素促使子宮內(nèi)膜從增殖期轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谄冢梢源龠M(jìn)子宮內(nèi)膜和乳腺上皮細(xì)胞的增生[13-14]。本研究初步顯示雌孕激素對(duì)口腔潰瘍具有一定的修復(fù)作用，與模型組對(duì)比，雌二醇聯(lián)合黃體酮可以有效提高口腔潰瘍大鼠的愈合能力，減少潰瘍面積。病理結(jié)果顯示雌二醇聯(lián)合黃體酮改善潰瘍病理改變，增加潰瘍組織膠原含量，改善膠原排列，恢復(fù)潰瘍組織上皮細(xì)胞排列。

TGF-β1 是由多種細(xì)胞分泌的促進(jìn)細(xì)胞增殖的因子，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化具有重要作用，在組織生長、創(chuàng)傷修復(fù)及細(xì)胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用[15]。本研究為進(jìn)一步研究雌激素和孕激素對(duì)口腔潰瘍的作用機(jī)制，通過免疫組化和PCR 對(duì)TGF-β1 的蛋白表達(dá)與基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，雌二醇和黃體酮可以增加TGF-β1 mRNA 的表達(dá)，蛋白表達(dá)增加不明顯。但雌二醇聯(lián)合黃體酮可以明顯增加蛋白和mRNA表達(dá)，提示雌激素和孕激素聯(lián)合可以增加組織愈合能力與TGF-β1 信號(hào)途徑有關(guān)。

角化層是上皮細(xì)胞成熟的表現(xiàn)標(biāo)志，具有重要的功能[16]。Keratin 5 是牙齦表皮角蛋白的一種，也是上皮細(xì)胞分裂能力和成熟的重要標(biāo)志[17-18]。免疫組化結(jié)果顯示：Keratin 5 主要表現(xiàn)在口腔黏膜的細(xì)胞角化層，雌二醇和黃體酮聯(lián)合可以增加Keratin 5 的表達(dá)，主要分布在上皮細(xì)胞的角化層、顆粒層和棘層，說明雌激素和孕激素可以促進(jìn)口腔黏膜潰瘍上皮細(xì)胞的修復(fù)和成熟。

本研究初步顯示：雌二醇和黃體酮可以有效促進(jìn)大鼠口腔潰瘍的愈合，促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞的功能恢復(fù)和皮下膠原纖維的增殖，提示雌孕激素與口腔潰瘍的發(fā)病和愈合有一定聯(lián)系。但口腔潰瘍的發(fā)生是否與口腔黏膜雌孕激素受體的亞型和分布有關(guān)，以及在男性口腔潰瘍的發(fā)病中是否也存在內(nèi)分泌異常等內(nèi)容尚未涉及，需要進(jìn)一步研究探討。