一株多重耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥性及分子分型

林 德，李斯彥，謝海柔，趙淑芳*

（1.麗水學院附屬第一醫院 檢驗科，浙江 麗水 323000；2.麗水學院醫學院，浙江 麗水 323000）

肺炎克雷伯菌是社區和醫院感染的重要致病菌，為革蘭氏陰性桿菌。肺炎克雷伯菌具有莢膜，分泌黏液，常常引起肺炎、敗血癥、尿路感染等癥狀，病死率較高[1]。隨著廣譜抗菌素的廣泛使用，細菌易產生耐藥性。

碳青霉烯酶類抗生素屬于β- 內酰胺酶抗生素的一類，能有效治療超廣譜β- 內酰胺酶和持續高產頭孢菌素酶的革蘭氏陰性桿菌感染，包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南等,是目前臨床上治療產ESBLs 和AmpC 酶肺炎克雷伯菌感染的首選藥物[2]。隨著碳青霉烯酶類抗生素的廣泛應用，耐碳青霉烯類抗生素的肺炎克雷伯菌不斷出現，給臨床治療和院感控制帶來挑戰。

肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制主要包括：碳青霉烯酶的產生、細菌外膜通透性的下降、外膜主動外排泵系統的表達、細菌生物膜的形成以及細菌抗生素靶位的改變等[3-4]。其中產碳青霉烯酶是引起碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的最主要機制[5]。碳青霉烯酶包括3 類：A 類，即獲得性碳青霉烯水解酶（2f 群），包括KPC，NMC，IMI，SME，GES，BIC 等；B 類，即金屬酶，包括IMP，NDM，VIM，GIM 等；D 類，即OXA 酶，包括OXA23，OXA24，OXA25，OXA26，OXA27，OXA-48，OXA-51，OXA-58 等[6-8]。

2001 年，Yigit 等首次發現了一種新型的非金屬碳青霉烯酶KPC-1[9]。我國浙江地區于2004 年發現并報道了產KPC-2 碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌菌株[10]。KPC 酶包含多個亞型，主要以KPC-2 和KPC-3 為主[11]。我國最常見的肺炎克雷伯菌是產碳青霉烯酶KPC-2 的ST11 型菌株[10-12]。

經鑒定，我們從臨床分離的肺炎克雷伯菌多重耐藥菌株的分子分型為ST11，產KPC-2 碳青霉烯酶。1 材料與方法

1.1 實驗材料

2016 年從麗水市臨床醫院獲得疑似肺炎克雷伯菌株1 株。

1.2 儀器和試劑

全自動快速生物質譜檢測系統IVD MALDI Biotyper 2.3（德國BRUKER 公司）；PCR 儀（美國BioRad公司）；電泳儀(美國BioRad 公司)；凝膠成像系統（美國BioRad 公司）；藥敏片購自英國OXOID 公司；肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 和肺炎克雷伯菌ATCC 700603 購自北京普天同創生物科技有限公司，大腸埃希菌ATCC 25922 為麗水市人民醫院檢驗科實驗室保存的菌株。PCR 試劑購自康為世紀生物科技股份有限公司。MH 培養基購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株鑒定采用全自動快速生物質譜檢測系統IVD MALDI Biotyper 2.3 進行質譜分析并快速鑒定。挑選出優勢單菌落涂布于靶板上，取1μL 的細菌測試標準品作為質量控制。待樣本干燥后，加入1μL基質液，晾干，放入儀器中進行檢測。依據Bruker 公司的推薦方法校正、比對、打分，最終得出鑒定結果。利用MALDI-Biotyper 數據庫軟件進行PCA 分析并構建發育樹，對待測菌進行同源性分析[13-14]。

1.3.2 藥敏試驗

所采用的抗菌藥物為：頭孢他啶、環丙沙星、呋喃妥因、復方新諾明、阿米卡星、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南。藥敏程度解讀參考美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2021 標準執行[15]，肺炎克雷伯菌ATCC 700603 和大腸埃希菌ATCC 25922 為對照菌株。

1.3.3 mCIM 試驗

依據文獻［16］的方法進行mCIM 試驗，即取1μL 接種環的細菌于2 mLTSB 培養基中，震蕩14 s；將10μg 美羅培南藥敏片（MEM）浸入菌懸液中，35 ℃培養4 h；在上述菌懸液培養了約3 h 后，配制0.5 麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC25922 菌懸液。用無菌棉簽均勻涂布在MH 瓊脂板上，在15 min 內完成，干燥3～10 min；4 h 培養結束后，取出MEM藥敏片，擠去多余的菌液，貼至上述涂布了ATCC25922 菌懸液的MH 瓊脂平板上，35 ℃培養18～24 h；測量抑菌圈的直徑（mm） 并記錄。其中肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 作為陽性對照菌株，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 作為陰性對照菌株[16]。

1.3.4 PCR 檢測

用煮沸法提取細菌DNA[17]，采用PCR 方法擴增耐藥相關基因blaKPC-2，blaBIC，blaIMP，blaAIM，blaGIM，blaNDM，blaDIM，blaSME，blaOXA-48和外膜孔蛋白基因blaOmpk-35，blaOmpk-36。大腸埃希菌ATCC 25922 作為陰性對照。

PCR 具體程序：95 ℃處理5 min；95℃變性45 s，在退火溫度退火45 s，72 ℃延伸30 s，進行30 次循環，最后72 ℃延伸5 min。具體引物、退火溫度和PCR 產物長度，見表1。

表1 （續）

表1 肺炎克雷伯菌的耐藥相關基因及外膜孔蛋白基因的PCR 引物

1.3.5 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）

對MLST website 提供的肺炎克雷伯菌的7 個管家基因（gapA，infB，mdh，pgi，phoE，rpoB 和tonB）的引物（表2）進行合成，再按照網站提供的PCR 程序進行PCR 擴增[14]，產物直接送上海生工生物工程有限公司進行純化并測序，再對測序結果進行比對。

表2 肺炎克雷伯菌的7 個管家基因的PCR 引物

2 結 果

2.1 實驗菌株的藥敏結果

依文獻［15］判斷藥敏結果。該菌株對頭孢他啶、環丙沙星、呋喃妥因、復方新諾明、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南8 種藥物耐藥，僅對阿米卡星敏感（表3）。

表3 實驗菌株對9 種抗生素的藥敏試驗結果

2.2 實驗菌株的mCIM 表型試驗結果

依文獻［16］判斷mCIM結果。測量實驗菌株的美羅培南藥敏片的抑菌圈直徑（d）為6 mm，實驗菌株的mCIM 表型試驗為陽性（圖1），說明該菌株為表達碳青霉烯酶的表型。其中肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 作為陽性對照菌株（抑菌圈直徑d=6 mm），肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 作為陰性對照菌株（抑菌圈直徑d=21 mm）。

圖1 mCIM表型試驗

2.3 實驗菌株的耐藥相關基因檢測結果

PCR 擴增設計的blaKPC-2基因的產物大小為784 bp，PCR 結果顯示實驗菌株檢測出耐藥相關基因blaKPC-2特異條帶（圖2），未檢測出其他耐藥相關基因blaBIC，blaIMP，blaAIM，blaGIM，blaNDM，blaDIM，blaSME，blaOXA-48，檢測出正常的外膜孔蛋白基因blaOmpk-35和blaOmpk-36，未檢測到缺失片段的外膜孔蛋白基因。大腸埃希菌ATCC 25922 作為陰性對照菌株。將blaKPC-2擴增出的特異條帶進行膠回收后送測序，經比對，測序結果為blaKPC-2基因的序列片段。

圖2 PCR 擴增結果

2.4 實驗菌株的MLST 基因分子分型結果

將實驗菌株的gapA，infB，mdh，pgi，phoE，rpoB 和tonB 這7 個基因擴增后，送上海生工生物工程有限公司測序，提交測序結果至MLST 分型網站，顯示該菌株MLST 分型為ST11 型。

3 討 論

本研究的肺炎克雷伯菌菌株為多重耐藥且表達碳青霉烯酶KPC-2 的ST11 型菌株。產KPC-2 的肺炎克雷伯菌主要以ST258 型和ST11 型為主[11]。在歐美國家主要流行ST258 序列型，該序列型的菌株主要為多重耐藥的[18]，而我國最常見的肺炎克雷伯菌是產碳青霉烯酶KPC-2 的ST11 型菌株[10-12]。同時，產碳青霉烯酶KPC-2 和KPC-3 的菌株是最常見的菌株類型[18]。

本研究中的ST11 型耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對多種抗生素耐藥，但對阿米卡星敏感，阿米卡星屬于氨基糖苷類抗生素。有報道表明ST11 型的耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對阿米卡星耐藥[12]，這與本研究的結果相反。也有研究表明耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對阿米卡星敏感[19]，與本研究結果一致。有文獻報道用氨基糖苷類抗生素和其他抗生素聯合治療耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌引起的疾病，取得了一定的療效[12，20]。但臨床上較少單獨使用阿米卡星來進行治療，因為阿米卡星具有較大的腎毒性。

本研究中攜帶blaKPC-2耐藥基因的多重耐藥肺炎克雷伯菌菌株對頭孢他啶、環丙沙星、呋喃妥因、復方新諾明、哌拉西林、亞胺培南、美羅培南、厄他培南8 種藥物均耐藥，僅對阿米卡星敏感。本研究將給臨床醫療工作人員在治療耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的感染及用藥選擇上提供線索和參考。