基于網絡藥理學探討葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機制

朱 旭 張 博 張思萌 夏曉萌 吳登斌*

2017年中國惡性腫瘤流行病學分析，每年至少49.9萬例新發盆腔惡性腫瘤[1]，其中20%～60%需要放射治療[2]。由于小腸上皮細胞對放療高度敏感，放射性腸炎是放射治療過程中的主要并發癥，是小腸和大腸在接受放射治療過程中出現的放射性損傷炎癥反應[3]。其表現為急性或慢性腹瀉、便血和里急后重，嚴重影響腫瘤患者的生命質量。放射性腸炎成為直腸癌等腹部腫瘤放射劑量增加的限制性因素。漢代名醫張仲景在《傷寒雜病論》中對葛根芩連湯進行了詳細描述，方劑由葛根、黃芩、黃連及甘草4味中藥組成，主治太陽表證、協熱下利，是治療濕熱所致腹瀉和痢疾的經典方。近年來發現其治療放射性腸炎腸道濕熱證療效較好[4-7]。本研究運用網絡藥理學方法就葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機制進行分析。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 收集葛根芩連湯活性成分、作用靶點等信息

以“葛根、黃芩、黃連、甘草”為關鍵詞，在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）進行檢索，以每味中草藥的化學成分、類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為篩選依據，對藥物的有效成分進行篩選。然后在數據庫內以有效成分為依據進行檢索，對其作用靶點進行確定。然后在Uniprot數據庫內導入作用靶點，進行基因標準化處理。

1.2 方法

1.2.1 葛根芩連湯共同作用靶點的篩選 將葛根芩連湯通過基因標準化處理得到的基因名稱全部導入Excel表格中，取交集函數，篩出葛根芩連湯共同作用靶點，并對“葛根芩連湯潛在作用靶點”用imageGP工具繪制韋恩圖。

1.2.2 收集放射性腸炎靶點信息 以放射性腸炎相關的靶點、"radiation enteritis" "radiation enteropathy"為關鍵詞在GeneCards數據庫內進行檢索，然后合并兩個數據庫檢索出的靶點，再在Uniprot數據庫內導入作用靶點，進行基因標準化處理。

1.2.3 收集葛根芩連湯治療放射性腸炎靶點及分析 在Excel表格中導入放射性腸炎背景網絡及葛根芩連湯的作用靶點，取交集，得到葛根芩連湯治療放射性腸炎的共同潛在基因靶點。再將共同作用的靶點、靶點所對應的葛根芩連湯活性成分、葛根芩連湯分別導入Cytoscape3.7.2軟件中，構建“葛根芩連湯-治療成分-靶點-放射性腸炎網絡圖”，對網絡節點的重要性通過Cytoscape3.7.2中“NetworkAnalyzer”功能對自由度（Degree）等網絡拓撲參數進行分析。

1.2.4 構建靶蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡及擴充靶蛋白

在String數據庫內輸入獲得的放射性腸炎治療的作用靶點，物種選擇“Home sapiens”，模式選擇“multiple proteins”，在默認設置下，得到PPI網絡，通過Cytoscape 3.7.2中“NetworkAnalyzer”功能對所獲取數據進行Degree等網絡拓撲參數分析。

1.2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8數據庫內輸入擴充靶點及葛根芩連湯治療放射性腸炎的共同作用靶點，分別進行GO富集分析、KEGG通路富集分析，將所獲得的結果導入Excel表格，篩選設定P≤0.05，根據P值將GO生物過程和KEGG 通路由小到大排序，選取前10位的GO生物過程和KEGG通路，利用imageGP工具繪制葛根芩連湯治療放射性腸炎主要GO生物過程氣泡圖和葛根芩連湯治療放射性腸炎的KEGG通路氣泡圖。

2 結果

2.1 葛根芩連湯作用靶點信息收集

共篩選出128個有效活性成分，其中葛根、黃芩、黃連、甘草分別為3個、31個、9個、88個，葛根芩連湯的主要活性成分見表1。在TCMSP數據庫內輸入128個有效成分，得到潛在作用靶點2 191個。通過Excel刪除重復值，得到261個基因靶點是葛根芩連湯共同的潛在作用靶點。

表1 葛根芩連湯主要活性成分

2.2 葛根芩連湯治療放射性腸炎靶點的收集及網絡構建和分析

獲得人類放射性腸炎相關靶點共41個。取交集后得到相關靶點基因8個，分別為TGFB1，NOS2，EGF，IL-6，MMP1，THBD，SERPINE1，MPO（圖1）。

圖1 葛根芩連湯與人類放射性腸炎共作用靶點

2.3 靶PPI網絡的構建

PPI網絡包含78個節點，1 196條邊(節點間的相互作用關系)，平均Degree值為30.7。此網絡中Degree 值大于等于30的從高到低排序依次為IL-6，VEGFA，EGF，TNF，IGF1，CXCL8，SRC，EGFR，MMP9，SERPINE1，TGFB1，TIMP1，STAT3，IL-10，ERBB2，IL-4，PLG，CCL2，HRAS（圖2）。

圖2 葛根芩連湯關鍵靶點PPI網絡

2.4 GO和KEGG通路分析結果

得到20個生物過程（GO）前10位的分別為細胞遷移的正向調控，MAPK信號通路，細胞黏附，上皮細胞的增殖，白細胞遷移，蛋白轉運的正向調節，信號受體活動的正向調節，miRNA基因沉默機制中的產物，調節上皮細胞的凋亡，細胞外基質組織（圖3）。得到16條KEGG通路，前5位的分別為細胞分化的負向調控，凋亡信號通路，RNA聚合酶Ⅱ正向調控pri-miRNA轉錄，多細胞生物的體內平衡，上皮細胞遷移的調節（圖4）。

圖3 GO生物過程

圖4 KEGG通路氣泡圖

通過GO富集分析顯示黏附斑激酶（FAK）及其信號通路，人巨細胞病毒感染，感染性腸道疾病，Th17細胞分化，胃癌，Rap1信號通路，relaxin信號通路，細胞因子-細胞因子受體相互作用，MAPK信號通路，胰腺癌，PI3K-Akt信號通路，foxo信號通路，乙型肝炎病毒，HIF-1信號通路，膀胱癌，AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中，腫瘤蛋白多糖，EGFR酪氨酸激酶抑制劑等，是葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機制（圖5）。

圖5 GO富集分析

3 討論

近年的研究認為放射性腸炎的發生與腸上皮細胞的直接損傷，腸道微生物黏膜屏障破壞，輻射誘發細胞因子介導的腸道炎癥等機制有關[8]。多年的臨床實踐發現葛根芩連湯對于預防和治療腸道炎癥能夠起到一定的作用[9-10]。現代藥理研究表明葛根芩連湯能降低血清IL-6、TNF-α的表達，減輕腸道炎癥反應[11]，調控MMP-9/P38MARK途徑減輕腸道黏膜損傷，修復腸道黏膜上皮屏障等[12]。

本研究從網絡藥理學角度對葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機制進行探討，網絡分析顯示葛根芩連湯共有活性成分128種，GO富集分析以及KEGG通路富集分析結果顯示，葛根芩連湯對放射性腸炎損傷修復可能的機制最主要的首先包括FAK及其信號通路，FAK是一種酪氨酸激酶，可以通過刺激胞內PI3K-Akt信號通路影響下游foxo信號通路，調節HIF-1信號通路以及影響Ras/MAPK等信號通路，調控細胞的生長。其次是MAPK信號通路，通過促進上皮細胞的增殖，調節上皮細胞的凋亡、遷移，結合惡性腫瘤的臨床分析推測，葛根芩連湯治療放射性腸炎的機制首先與FAK及其信號通路、MAPK通路相關的促進上皮細胞的損傷修復有關。再次，葛根芩連湯對炎癥反應的影響，通過調控Th17細胞分化實現，Th17細胞與Th1/Th2細胞同屬免疫調節性T細胞，參與腸道炎癥反應，具有促炎癥、致炎作用。基于目前的網絡藥理學分析認為葛根芩連湯可能通過促進上皮細胞的修復，調節免疫細胞分化，治療放射性腸炎。近年來研究表明，腸道微環境中，腸上皮細胞、免疫細胞與腸道菌群是3個相互影響、密切相關的群體[13]，腸道微生物群維持上皮屏障的完整性并構建黏膜免疫系統，上皮細胞通過構建化學和物理屏障將腸道微生物與腸壁分離，從而構建宿主共生關系，腸道免疫細胞參與維持健康的微生物群和加強上皮屏障功能，因此推斷，葛根芩連湯在影響了上皮細胞的修復和免疫細胞的分化同時，會對腸道菌群產生影響。作為一種治療腹瀉的經典方劑，研究表明葛根芩連湯可以通過改變腸道內有益菌數量發揮治療疾病的作用[14]。但對于治療放射性腸炎是否有影響，還知之甚少，也是未來可以研究的方向。