左歸丸治療骨質疏松的網絡藥理學分析?

黃勝男， 張 穎， 王如然， 馮艷華， 黃浩然， 陳 君

(中國中醫科學院廣安門醫院南區， 北京 102618)

骨質疏松(osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，多見于絕經后婦女和老年男性。該病以骨量減少、骨微觀結構退化為病理特征，易導致脆性骨折的嚴重后果[1]。當前針對骨質疏松癥的治療藥物主要基于鈣制劑、維生素D以及雙磷酸鹽類藥物[2]。中醫認為，骨質疏松屬于中醫學“骨痿”“骨枯”“骨空”等范疇?！毒霸廊珪纷髿w丸是經典的補腎壯骨名方，由熟地黃、山藥、枸杞、山茱萸、鹿角膠、龜板膠、菟絲子、川牛膝組成，具有滋陰補腎、填精益髓之效，臨床用藥歷史悠久，如采用經方左歸丸治療絕經后骨質疏松[3]、肝腎不足證骨質疏松[4]等。課題組前期在臨床與實驗研究中，應用左歸丸治療腎虛型骨質疏松療效確切[5，6]。當前針對左歸丸的作用機制研究取得了一定的進展。有報道顯示，其可通過調控AMPK/mTOR信號通路促進絕經后骨質疏松癥大鼠骨形成[7]。另有研究顯示，左歸丸對于去勢骨質疏松模型大鼠的Wnt/β-catenin通路具有一定的調控作用[8]。此外，OPG/RANKL信號通路[9]以及鈣轉運相關通路[10]也被證明是左歸丸的潛在作用機制，但其藥效物質基礎與作用機制的相關性還有待進一步闡明。

網絡藥理學是基于藥物分子、作用靶點、疾病三者的生物網絡構建，預測藥物對疾病作用機制的新興學科[11]，并以其具有的整體性、系統性的學科特點，與傳統中醫整體觀、辨證論治的個性化治療高度契合，因此被廣泛用于中藥及其復方藥效成分與作用機制相關性的預測。本研究將運用網絡藥理學方法，探討左歸丸多靶點、多途徑治療骨質疏松的作用機制，以闡釋其“補腎壯骨”治法的生物學基礎。

1 方法

1.1 左歸丸中藥信息收集及靶標數據庫構建

從《中華人民共和國藥典》一部(2020年版)(簡稱《藥典》)查找左歸丸所含8味中藥(熟地黃、山藥、枸杞子、鹿角膠、龜甲膠、川牛膝、菟絲子)的歸經信息；以中藥的拼音名為檢索詞，從TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和/或BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索該中藥化學成分及對應靶標。TCMSP的篩選標準為口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18[12]，剔除沒有靶標信息的化學成分，從 Uniprot(http://www.uniprot.org/)將相應靶標蛋白名轉換為基因名；BATMAN-TCM數據庫篩選標準為Score cutoff ≥20、P值≤0.05，收集化學成分和靶標[13]。

1.2 骨質疏松相關基因數據庫的構建

以“osteoporosis”為檢索詞，搜集DisGeNET數據庫(http://www.disgenet.org/)[14]和Drugbank數據庫(https://www.drugbank.ca/)[15]中治療骨質疏松的潛在靶點，DisGeNET數據庫中篩選標準為Score_gda≥0.4；Drugbank數據庫中“targets”名稱通過 Uniprot轉換為基因名。

1.3 網絡構建與分析

利用Cytoscape3.7.1軟件構建和分析左歸丸治療骨質疏松的中藥-歸經網絡、靶標-疾病網絡。中藥-歸經網絡是將中藥拼音名和相應歸經分別導入Cytoscape3.7.1軟件，分析網絡參數(連接度)；靶標-疾病網絡是導入高質量蛋白組學數據庫HINT(High-quality INTeractomes)中物種為人的高質量二元蛋白-蛋白相互作用網絡作為背景網絡[16]，把骨質疏松疾病基因映射到HINT網絡，提取疾病基因網絡，再將左歸丸靶標基因與疾病基因取交集后，映射到疾病基因網絡，提取網絡節點和邊，保留最大連通片，再進行Community cluster(Glay)分析并分解成網絡子模塊。

1.4 重要靶標功能富集分析

采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)平臺分別對左歸丸靶標分布較多的網絡子模塊中節點基因進行功能富集分析[17]。選擇蛋白相互作用(Protein Interactions)功能聚集分析(Functional Annotatin Clustering)，分析網絡子模塊蛋白功能；通過京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析，獲得左歸丸治療骨質疏松的重要信號通路。

2 結果

2.1 中藥-歸經網絡分析

左歸丸所含的8味中藥歸肝(Liver)、腎(Kidney)、脾(Spleen)、心(Heart)、肺(Lung)經(見圖1)，網絡連接度排名前2位的是腎經、肝經，分別為8、7，即左歸丸所含的8味中藥全部都歸腎經，7味歸肝經，2味歸脾經，各有1味中藥歸肺經和心經。

注：① 圓形節點代表歸經，方形節點代表中藥；②圖形面積越大連接度越大圖1 中藥-歸經網絡圖

2.2 左歸丸含化合物及對應靶標

山藥、枸杞子、川牛膝、菟絲子的成分及靶點信息來源于TCMSP數據庫，鹿角膠和龜甲膠來源于BATMAN-TCM數據庫，熟地黃來源于TCMSP和BATMAN-TCM數據庫。左歸丸復方中包含73個化合物537個靶標(見表1)。

表1 左歸丸包含中藥所含化合物及潛在靶標個數

2.3 骨質疏松相關基因

以“osteoporosis”為檢索詞，從DisGeNET數據庫獲得366個靶點基因，從Drugbank數據庫中獲得50個基因，其中9個基因同存在于該2個數據庫，去重后共獲得407個可能與骨質疏松相關的靶點基因，與左歸丸靶標基因數據庫取交集獲得51個重復基因(見圖2)。DisGeNET、Drugbank、左歸丸靶標數據庫三者交集3個基因，即ESR1、ESR2、FDPS。

圖2 左歸丸靶標與骨質疏松基因數據庫韋恩圖

2.4 左歸丸靶標網絡分析

Cytoscape3.7.1軟件構建左歸丸靶標網絡，取最大連通片進行分析(見圖3)。該網絡有118個節點，聚成7個子模塊，不同子模塊代表功能密切相關蛋白之間相互作用下完成特定的分子功能。左歸丸靶標節點主要分布在子模塊1、2、3。通過計算受控分衡量左歸丸對靶標作用的強弱，即中藥-化合物靶向某靶標的數量[16]，網絡中共有11個節點的受控分大于或等于5。從靶標網絡圖可見，受控分排名靠前的節點是PTGS2、PIK3CG、PPARG、AR、BAX等。

注：藍色節點為骨質疏松疾病基因，紅色節點為左歸丸治療骨質疏松的靶標基因；節點大小與受控分數成正比圖3 左歸丸靶標網絡圖

2.5 左歸丸重要靶標的功能富集分析

將左歸丸靶標網絡圖主要的3個子模塊(見圖3)節點基因分別輸入DAVID中進行功能富集分析。

在DAVID中選擇蛋白相互作用(Protein Interactions)功能聚集分析(Functional Annotatin Clustering)，模塊1中28個基因，聚成runt相關轉錄因子1(Runt-related transcription factor 1，RUNX1)、維生素D受體(vitamin d receptor，VDR)及叉頭盒蛋白O3(forkhead box protein O3，FOXO3)蛋白之間相互作用網絡。模塊2中25個基因，聚成血小板衍生生長因子B(platelet derived growth factor subunit b，PDGFB)、血小板反應蛋白(thrombospondin 1，THBS1)、血小板衍生生長因子A(platelet derived growth factor subunit a，PDGFA)等蛋白互作網絡；模塊3中20個基因，聚成有絲分裂原激活蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、有絲分裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)等蛋白互作網絡。

在DAVID中選擇通路分析(Pathways)中KEGG_PATHWAY分析，3個模塊共獲得70個信號通路，刪除其他疾病通路(如結腸直腸癌、Ⅰ型人T淋巴細胞白血病病毒感染等)，且P-value<1×10-2，共16個信號通路，其中子模塊1、2、3分別有4個、5個、7個信號通路(見表2)。

表2 左歸丸靶標網絡子模塊靶標富集的KEGG信號通路比較

3 討論

隨著計算機技術在生命科學中的應用和系統生物學的發展，網絡藥理學這一研究領域進展迅速，它基于系統生物學、藥理學、分子生物學等多學科技術，通過構建“活性成分-靶標-疾病”相互作用網絡，探討藥物和疾病之間復雜關系的研究方法[18]。近年來廣泛應用于中藥方劑配伍規律、中藥藥效等研究中[19]。

本研究采用網絡藥理學方法分析了左歸丸對骨質疏松的潛在藥效機制。首先，基于《藥典》中中藥及歸經信息，構建中藥-歸經網絡；結合疾病基因數據庫和中藥活性成分及靶點數據庫構建靶標網絡，預測重要靶標干預的生物學通路，揭示左歸丸“補腎壯骨”用藥依據和多成分、多靶點分子機制。

中藥-歸經網絡中，左歸丸君藥熟地黃入肝、腎經，滋腎填精益髓；山藥歸脾、肺、腎經，養肝滋腎，平補三陰；山茱萸、枸杞子歸肝、腎經，補腎益精；龜甲膠歸肝、腎、心經，鹿角膠歸肝、腎經，二者為血肉有情之品，峻補精髓，5味中藥共為臣藥；菟絲子歸肝、腎、脾經，川牛膝歸肝、腎經，二者益肝腎、強腰膝、健筋骨，為佐藥。諸藥合用，組成入肝腎經為核心的歸經網絡，為詮釋左歸丸“補腎壯骨”的科學內涵奠定基礎。

左歸丸的靶標網絡是一個多靶點參與的復雜交錯網絡，其中PTGS2、PIK3CG、PPARG、AR、BAX等是受控分排名靠前，可能是左歸丸的關鍵靶標。研究顯示，PTGS2是前列腺素生成的限速酶，前列腺素可誘導核因子-κβ受體活化因子配體的表達，促進破骨細胞分化[20]；PPARG抑制骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[21]；AR是雄激素受體，雄激素與成骨細胞表面AR結合促進成骨分化[224]；促凋亡因子BAX與骨細胞凋亡相關[23]，可見左歸丸可能通過多靶點影響成骨、破骨細胞分化及骨細胞凋亡等發揮治療作用。

重要靶標的功能富集分析顯示，左歸丸可能作用于多個信號通路：①靶標網絡子模塊1主要涉及轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-beta)、雌激素(Estrogen)、甲狀腺激素(Thyroid hormone)等信號通路，它們均與成骨分化有關。Thyroid hormone信號通路中甲狀腺激素影響堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表達，從而影響骨鈣蛋白和成骨細胞分化[24]；TGF-β信號通路可通過下游Smad通路調節成骨分化和骨形成[25]；Estrogen信號通路可利用雌激素調控骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨分化[26]；②靶標網絡子模塊2主要涉及磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B,PI3K-Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ras相關蛋白1(Ras-related protein 1，Rap1)等信號通路。PI3K-Akt信號通路是調控成骨細胞和破骨細胞功能的信號通路網中心，具有調節成骨細胞和破骨細胞功能的雙重作用[279]；MAPK信號通路主要包含細胞外信號調節激酶1/2(Extracellular regulated kinase 1/2, ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、細胞外信號調節激酶5(extracellular signal regulated kinase,ERK5)通路，可激活各自不同的轉錄因子且相互聯系，誘導成骨分化和骨形成[28]；Rap1屬Ras超家族小分子量G蛋白，骨組織、骨細胞有RAS分布，一些調控骨代謝的信號分子(如TGF-β) 促進Ras與GTP結合及活化，啟動Ras-MAPK磷酸化級聯反應，激活ERK1/2，調控下游骨細胞活動[29]；③靶標網絡子模塊3主要涉及神經營養因子(Neurotrophin)、鞘脂類(Sphingolipid)、破骨細胞分化(Osteoclast differentiation)等信號通路。Osteoclast differentiation通路也與PI3K-Akt、NF-κβ、MAPK等多個信號通路密切相關，調控破骨細胞的分化與成熟；Neurotrophin是神經營養相關信號通路，Sphingolipid是鞘脂類信號通路，它們與骨質疏松的相關性尚不明確?？梢?，左歸丸可能作用于多個信號通路，且不同的信號通路之間還存在廣泛的相互作用及復雜的信號傳導機制，為左歸丸作用機制研究帶來巨大挑戰。

本研究為提高網絡藥理學研究方法預測結果的可信度，分別納入TCMSP、BATMAN-TCM 2個中藥數據庫和Drugbank、DisGeNET 2個疾病靶點數據庫，視數據量大小取兩類數據庫的交集或并集構建網絡。在左歸丸靶標篩選中發現，ESR1、ESR2、FDPS在DisGeNET、Drugbank、TCMSP數據庫中均有收錄，提示它們作為左歸丸潛在標靶可信度非常高。ESR1、ESR2編碼雌激素受體，介導雌激素發揮生物學作用的核內生物大分子；FDPS是雙膦酸鹽類藥物關鍵靶點。研究表明，左歸丸含藥血清能上調成骨細胞MC3T3-E1雌激素受體蛋白表達[30]，能協同唑來膦酸抗骨質疏松[31]。左歸丸是否具有雌激素和雙膦酸鹽樣雙重作用，在實驗研究中值得關注。