不同酵母發酵蘋果冰酒香氣成分分析

◎ 白啟正，趙志聰，連 琛，安貴陽

（西北農林科技大學 園藝學院，陜西 咸陽 712100）

蘋果冰酒是借鑒傳統冰酒釀造工藝的經驗，結合水果和果酒的特點，創新出的一種全新的果酒品種。加拿大對蘋果冰酒的定義是通過發酵高糖度（白利糖度＞30%）的濃縮蘋果汁，使其殘余糖度≥130 g·L-1，酒精度在7%～13%的果酒。其生產過程不添加糖、酒精、人工色素或香料。冰蘋果酒具有清香可口、甘甜醇厚、冷藏后甘甜爽口的特點[1-3]。酵母是釀造果酒的關鍵因素之一，不同的酵母菌株種類酶活性存在差異，對所處發酵條件環境的適應力不同，導致每個酵母菌種的特性不同，由其發酵產物代謝的糖、酸、甘油和香氣成分也會有所不同[4-5]。在蘋果冰酒生產過程中，需要選擇具有優良性狀的酵母，能產生足夠的香氣成分。在果酒的發酵過程中，酵母在利用糖轉化生產酒精的同時，還會產生其他副產物，如甘油、高級醇類等[6-7]。這些代謝物包括有機酸、醇類、酯類、酮類、烷烴和胺類物質[8]。酵母菌株對蘋果酒的香氣物質有著重要的影響，酵母的選擇是優化釀造工藝的重要組成部分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果，品種為延長紅，產于陜西省洛川縣西北農林科技大學蘋果試驗站。7種市售酵母如下所示。歐法朗斯低溫發酵冰葡萄酒酵母（La Fruitee，以下簡稱La-Fu），法國Sofralab公司；歐法郎斯芳香型葡萄酒酵母（L’Eclatante，以下簡稱L-Ec），法國Sofralab公司；葡萄酒釀酒酵母F33（Actiflore F33，以下簡稱F33），法國LAFFORT公司；安琪葡萄酒果酒專用酵母RW（以下簡稱RW），安琪酵母股份有限公司；安琪葡萄酒果酒專用酵母SY（以下簡稱SY），安琪酵母股份有限公司；白葡萄酒酵母X5（Zymaflore X5，以下簡稱X5），法國LAFFORT公司；干白葡萄酒酵母X16（Zymaflore X16，以下簡稱X16），法國LAFFORT公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010 SE氣相色譜質譜聯用儀，日本島津公司；RDN-1000D-4型人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；Uni Bloc電子天平，日本Shmadzu公司；HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細管色譜柱，美國Agilent公司；SPME手柄、57329-U DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

冰蘋果汁中分別接種7種酵母，綜合比較蘋果冰酒的理化和感官指標，篩選出適合洛川地區蘋果冰酒發酵的酵母菌種。

1.3.2 蘋果冰酒釀造工藝流程及操作要點

蘋果酒發酵工藝為冰蘋果帶冰采摘→分選→破碎、榨汁→護色、殺菌→調糖、調酸→酵母活化、接種酵母→密封發酵→過濾、澄清→蘋果冰酒。

（1）原料的采摘與分選。原料選自西北農林科技大學洛川蘋果試驗站延長紅品種，在自然條件下結冰完成蘋果糖分的富集（環境溫度低于-10 ℃）。帶冰采摘，去除霉爛果。

（2）冰蘋果發酵汁的制備。冰蘋果分選后，用旋轉式去核機將冰蘋果去核并切分為塊狀，再利用破壁機將原料在低溫條件下榨汁，不加水（環境溫度低于-4 ℃）。榨取后的冰蘋果汁靜置4 h，之后用12層紗布過濾2次，對得到的汁液進行糖度測定，此時Brix值為為23，通過調糖將Brix值調整為30；加入檸檬酸將發酵汁的pH調到3.5。

（3）果汁處理。向果汁中加入偏重亞硫酸鉀（120 mg·g-1），偏重亞硫酸鉀是一種食品抗氧化、抑菌劑，可為果汁中提供SO2，達到護色、抑菌的效果。

（4）酵母活化。將購得的7種酵母干粉按照酵母∶水=1∶10的比例加入35～40 ℃的純凈水，再加入3%的糖加速活化過程，輕輕攪拌后靜置15 min，之后再次攪拌，待30 min泡沫豐富后酵母活化完成，加入果酒中。

（5）發酵過程。發酵溫度20 ℃，酵母添加量為0.45 g·L-1，在密閉發酵瓶中進行發酵。

（6）終止發酵。以Brix值降到15為發酵終點，向果酒中加入120 mL/100 L偏重亞硫酸鉀終止發酵。從第8 d開始每天測定Brix值，記錄不同酵母發酵果酒發酵時間。

1.3.3 香氣成分測定

吸取樣品酒樣8 mL于15 mL的微萃取專用萃取瓶中，加入2 g NaCl，加入內標溶液（稀釋500倍的50 mg·L-1的三辛醇溶液），40 ℃條件下平衡15 min，插入已老化的萃取頭頂空吸附30 min。萃取完成后，取出萃取頭迅速插入氣相色譜儀進樣口在260 ℃條件下解吸3min。

1.3.4 儀器條件

（1）氣相色譜條件。色譜柱為HP-ⅠNNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為He氣（純度99. 999%）；柱流量1 mL·min-1；進樣口溫度260 ℃。色譜柱升溫程序為初始溫度50 ℃，保持3 min，然后以3.5 ℃·min-1升至120 ℃，保持3 min；再以13 ℃·min-1升至260 ℃，保持3 min。采用不分流方式進樣。

（2）質譜條件。電離方式EⅠ，電子能量70 eV；質量掃描范圍30～500 amu；離子源溫度240 ℃；接口溫度240 ℃。

1.4 數據分析

依據保留指數法進行定性分析。利用自動質譜圖解卷積和鑒定系統（Automatic Mass Spectral Deconvolution and Ⅰdentification System，AMDⅠS） 建立保留指數校正庫，利用保留指數及NⅠST11質譜庫，比對在同樣極性色譜柱條件下測得的香氣成分保留指數結果，從而進行定性。將定性結果依據可信度強弱進行分類并詳細記錄，確定各化學成分。采用峰面積歸一法求得各香氣組分在果實總體香氣物質中的相對百分含量。試驗采用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同酵母發酵蘋果酒揮發性香氣成分的GC-MS分析

采用氣相色譜-質譜聯用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）提取7種酵母發酵蘋果酒中的揮發性香氣物質，結果如表1、表2所示。從7個酵母品種發酵酒中共鑒定出44種化合物，包括酯類19種，有機酸類5種，醇類13種，其他類7種，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、異戊酸己酯、辛酸乙酯、順式-4-辛烯酸乙酯、癸酸乙酯、乙基-9-癸烯酸脂、十三烷酸乙酯、癸酸異戊酯、肉豆蔻酸乙酯、2-甲基丁酸、辛酸、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正己醇、蘑菇醇、正辛醇、順式5-辛烯-1-醇、芐醇、苯乙醇、甲基庚烯酮、癸醛、草蒿腦及八甲基硅油這28種是7種酵母所發酵蘋果酒共有的揮發性成分，但在不同品種酵母的發酵酒中含量有所差異。

表1 7種酵母發酵酒中香氣成分測定結果表

續表1

表2 7種酵母發酵酒揮發性香氣成分種類及相對含量表（單位：%）

2.2 不同酵母發酵蘋果酒揮發性香氣成分的種類和相對含量分析

在不同酵母品種發酵蘋果酒中主要揮發性香氣成分的種類和含量也有較大的差別。在7種酵母品種中，La-Fu所發酵蘋果酒中揮發性香氣物質種類最多，達到了39種，總相對含量達到93.94%，是7種酵母發酵蘋果酒中揮發性香氣物質相對含量最高的酵母品種；L-Ec酵母所發酵蘋果酒中揮發性香氣物質有37種，相對含量達到了91.10%；F33酵母所發酵蘋果酒中揮發性香氣物質有34種，相對含量達到了83.08%，是7種酵母發酵蘋果酒中揮發性香氣物質相對含量最低的酵母品種；RW酵母所發酵蘋果酒中揮發性香氣物質有36種，相對含量達到了88.99%；SY酵母所發酵蘋果酒中揮發性香氣物質有34種，相對含量達到了90.56%；X5酵母所發酵蘋果酒中揮發性香氣物質有32種，相對含量達到了90.98%；X16酵母所發酵蘋果酒中揮發性香氣物質有35種，相對含量達到了86.31%。

2.3 不同酵母發酵蘋果酒中揮發性香氣成分的分析

2.3.1 醇類物質

醇類化合物是在酒精發酵過程中酵母細胞分解氨基酸或糖類物質產生的次級產物，對果酒的香型起著重要作用[9]。在7組酵母發酵果酒中共檢測到13種醇類化合物，La-Fu酵母發酵酒中醇類物質為13種，醇類物質種類最多，香氣最為豐富。L-Ec酵母發酵酒中醇類物質為11種。F33酵母發酵酒中醇類物質有11種，醇類物質含量占比是7種酵母發酵酒中最高的，占香氣物質的46.70%。RW酵母發酵酒中醇類物質有10種。SY酵母發酵酒中醇類物質有9種。X5酵母發酵酒中醇類物質有10種。X16酵母發酵酒中醇類物質有9種。高級醇不僅使蒸餾酒呈現香氣還是醇甜和助香的主要物質來源。四氫薰衣草醇是La-Fu和L-Ec酵母發酵酒中特有的醇類香氣物質，其具有薰衣草樣花香香氣，帶有青草的辛香氣息，豐富了這兩種酵母發酵酒中香氣組成。順-4-癸烯-1-醇是La-Fu、L-Ec、RW 3種酵母發酵蘋果酒中特有的醇類香氣物質。在所有檢測到醇類物質中含量占比最多的是異戊醇，異戊醇有蘋果白蘭地香氣和辛辣味。我國GB 2760—2014規定其為允許使用的食用香料，主要用以配制蘋果和香蕉型香精。La-Fu、F33和RW這3種酵母發酵酒中異戊醇含量較高，分別為34.20%、35.90%和35.27%，具有濃重的蘋果香氣。香茅醇和D-香茅醇具有甜玫瑰香，在La-Fu和F33兩種酵母發酵酒中檢測到了香茅醇和D-香茅醇，X5酵母發酵酒中含有D-香茅醇。

2.3.2 酯類物質

酯類物質是發酵酒中主要的呈味和呈香化合物，各種酯類具有不同的花香和水果香，如乙酸乙酯具有菠蘿甜果味；丙酸乙酯有水果香；己酸乙酯有甜香、水果香、窖香；辛酸乙酯具有水果香氣，并有菠蘿、蘋果樣的香韻和白蘭地的酒香味；壬酸乙酯有玫瑰香、果香、酒香；癸酸乙酯具有葡萄果香、脂肪香、酒香；肉豆蔻酸乙酯具有鳶尾油香、油脂味[10]。

酯類物質在7種發酵產物中共檢測出19種，其中La-Fu有15種，相對含量占43.79%；L-Ec有16種，相對含量占49.13%；F33有15種，相對含量占30.46%；RW有18種，相對含量占41.42%；SY有18種，相對含量占56.93%，酯類物質相對含量在七種酵母發酵物中最多；X5有16種，相對含量占50.42%；X16有18種，相對含量占45.52%。酯類物質中含量較高的為正己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和乙基9-癸烯酸脂，相對含量見圖1。酯類物質中含量最高的是辛酸乙酯，帶來濃重的果香味與白蘭地酒香味，7種酵母發酵酒中辛酸乙酯相對含量分別為18.52%、20.70%、12.96%、17.25%、24.31%、22.64%和18.82%。

2.3.3 有機酸類

有機酸類對蘋果酒香氣也有一定的影響，在7種酵母發酵酒中共檢測到有機酸類物質5種。其中，La-Fu酵母發酵酒中5種物質都含有，總含量占2.665%；L-Ec酵母發酵酒中含有4種有機酸類物質，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸，總含量占1.84%；F33酵母發酵酒中有4種有機酸類物質，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸，總含量占2.56%；RW酵母發酵酒中檢測出3種有機酸類物質，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸和異己酸，總含量占1.89%；SY酵母發酵酒中檢測到3種有機酸類物質，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸和異己酸，總含量占1.61%；X5酵母發酵酒中只檢測到2種有機酸類物質，2,4-二甲氧基肉桂酸、異己酸和乙酸都未檢測到，總含量占1.08%；X16酵母發酵酒中檢測到3種有機酸類物質，未檢測出2,4-二甲氧基肉桂酸和異己酸，總含量占1.50%。有機酸類物質中含量最高的是辛酸，辛酸天然存在于蘋果中，呈水果香氣，可用于香料、殺菌劑的合成。

2.3.4 其他類物質

檢測到的其他類物質包括烯烴類物質、酚類物質、酮醛類物質、醚類物質及烷類物質。在7種酵母發酵酒中共檢測到7種其他類物質，其中，La-Fu酵母發酵酒中檢測出6種，占1.96%，沒有檢測到壬醛；L-Ec酵母發酵酒中檢測出6種，占2.21%，沒有檢測到3,5-二叔丁基苯酚，壬醛是該酵母發酵酒中特有的其他類物質；F33酵母發酵酒中檢測出4種，沒有檢測到2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚，其余總量占3.27%；RW酵母發酵酒中檢測出5種，沒有檢測到3,5-二叔丁基苯酚、壬醛，其余總量占1.37%；SY酵母發酵酒中檢測出4種，沒有檢測到2,4-二叔丁基苯酚、3,5-二叔丁基苯酚、壬醛，其余總量占0.71%；X5酵母發酵酒中檢測出4種，種類和SY酵母發酵酒一樣，總量占0.93%；X16酵母發酵酒中檢測出5種，沒有檢測到2,4-二叔丁基苯酚、壬醛，其余總量占0.73%。

3 結論

大量的研究表明，不同的酵母因對于不同液體環境適應力與特性不同，在發酵時，可以使發酵酒體表現出不同的香氣與口感，為酒體帶來不同的復雜度與豐富度，給予酒體獨特性。本研究表明，在不同酵母品種發酵蘋果酒中主要揮發性香氣成分的種類和含量也有較大的差別，La-Fu酵母所發酵酒中香氣成分物質種類最多，相對含量占比最大，酯類、醇類物質相對含量較高，風味豐富，是釀造蘋果冰酒的優秀酵母種類。