高效液相色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中的檸檬酸

◎ 譚凱燕

（廣西壯族自治區產品質量檢驗研究院，廣西 南寧 530200）

葡萄酒中只有少量無機酸，大部分是有機酸。葡萄酒中的有機酸是決定葡萄酒風味的重要物質，也是決定葡萄酒酸度的主要因素，有機酸在葡萄酒釀造過程中及釀造后均占有重要地位。葡萄酒中的有機酸主要包括蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乳酸和琥珀酸等，這些有機酸可調節葡萄酒的酸堿度，并直接影響葡萄酒的顏色、口感和生物穩定性。因此，葡萄酒中有機酸的定量測定對葡萄酒的品質鑒定具有重要意義[1]。

檸檬酸，又名枸櫞酸，天然檸檬酸在自然界中分布很廣，尤其是在果蔬中。在某些食品中加入檸檬酸后，可改善口感，促進食欲，還可促進身體的正常代謝，適當的劑量對人體無害，因此食品工業中其被廣泛用作酸味劑、抗氧化劑和穩定劑。在葡萄酒的釀造過程中，適當添加檸檬酸可以維持和穩定葡萄酒的顏色，并調節葡萄酒的口感[2]。但其使用量在國家標準中有嚴格限制，《葡萄酒》（GB/T 15037—2006）中規定，干、半干和半甜葡萄酒中檸檬酸的含量≤1 g·L-1，甜葡萄酒中檸檬酸的含量≤2 g·L-1。《葡萄酒》（GB/T 15037—2006）中檸檬酸指定的分析方法為《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038—2006）中的高效液相色譜法，按此方法測定葡萄酒中的檸檬酸時，由于葡萄酒中復雜基質的干擾，很難把檸檬酸完全分離出來，導致定性定量不準確[3-4]。目前，國內外報道中常見葡萄酒中檸檬酸的檢測方法有高效液相色譜法和離子色譜法，未見有高效液相色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中檸檬酸的檢測方法的報道。因此，有必要建立一種靈敏度高、定性定量準確、檢出限低的檢測方法，以改善上述方法的不足，研究建立高效液相色譜-串聯質譜法測定葡萄酒中檸檬酸含量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純Fisher；飲用純凈水：娃哈哈飲料有限公司；甲酸：色譜純，純度98%；水相濾膜：0.22 μm，CNW；有機濾膜：0.22 μm，CNW；檸檬酸標準品，純度為99.80%，Stanford Chemicals。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀：美國 AB Sciex公 司；AcclaimTM RSLC 120 C182.2 μm 2.1 mm×100 mm色譜柱：美國Thermo公司；AG-285電子天平：瑞士AMTTLE。

1.3 方法原理

試樣直接用蒸餾水稀釋后，經高效液相色譜分離，選擇質譜檢測器進行定性、定量。采用外標法定量檢測檸檬酸的含量。

1.4 試驗方法

1.4.1 流動相的配制

流動相A（0.1%甲酸-水溶液）：取500 μL甲酸（色譜純）加入500 mL飲用純凈水中，過0.22 μm水相濾膜，超聲混勻去CO2即可。

流動相B（乙腈）：色譜純，過0.22 μm有機濾膜，超聲去CO2即可。

洗針液（10%甲醇溶液）：取20 mL甲醇（色譜純）加入180 mL飲用純凈水中，過0.22 μm有機濾膜，超聲混勻去CO2即可。

1.4.2 檸檬酸標準儲備溶液

稱取0.05 g檸檬酸于50 mL容量瓶中，用飲用純凈水溶解并定容到刻度，充分混勻。檸檬酸質量濃度為1.0 mg·mL-1，作為標準儲備溶液，于2～4 ℃的冰箱冷藏儲存。

1.4.3 標準曲線溶液配制

將檸檬酸儲備溶液用飲用純凈水稀釋成濃度分別為 0 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、200 μg·L-1、400 μg·L-1和 1 000 μg·L-1的標準系列工作液。

1.4.4 儀器條件

（1）色譜條件。C18色譜柱，流動相為乙腈-0.1%甲酸/水（梯度洗脫，見表1），流速0.3 mL·min-1，柱溫 45 ℃，進樣量 5 μL[5]。

表1 梯度洗脫程序表

（2）質譜條件。電噴霧離子源，負離子模式（ESⅠ-）；多反應監測（MRM）模式，電噴霧電壓為-4 500 V，離子源溫度為550 ℃，霧化氣、氣簾氣壓力為55，按以上條件對檸檬酸的離子對進行摸索，最終確定目標化合物的離子對條件，見表2[5]。

表2 檸檬酸質譜監測參數條件表

1.4.5 樣品的制備

移取1.0 mL葡萄酒樣品放入100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至刻度，混合均勻，過0.22 μm水相濾膜于進樣瓶中，待測。

1.4.6 空白試驗

不加樣品，蒸餾水過0.22 μm水相濾膜于進樣瓶中，待測。

1.5 結果計算

樣品中檸檬酸的含量按式（1）計算。

式中：X為樣品中檸檬酸的含量，g·L-1；c為測定溶液中檸檬酸的含量，μg·L-1；V為樣液的最終定容體積，mL；m為取樣量，mL；f為樣品的稀釋倍數；1000 000 為 μg·L-1轉換為 g·L-1的換算因子。

2 結果與分析

2.1 標準曲線、線性范圍和方法檢出限

從圖1可知，此高效液相色譜-串聯質譜法測得檸檬酸在0～1 000 μg·L-1范圍內標準曲線的相關系數為0.999 5。該方法的最低檢出限為0.05 mg·L-1，最低定量限為0.15 mg·L-1（以葡萄酒樣品稀釋10倍時計算）。

2.2 回收率和精密度

向葡萄酒樣品中分別加入檸檬酸標準品后，按照1.4.5步驟進行回收試驗的驗證，在不同濃度水平上（50 μg·L-1、200 μg·L-1、1 000 μg·L-1）加標，每個加標濃度均進行6次平行試驗。回收率最低為90.1%，最高為107.0%，平均回收率為96.0%，相應的變異系數（RSD）為2.1%～7.6%，說明該試驗的回收率和精密度較好。

2.3 樣品的測定

10個不同廠家的葡萄酒樣品按1.4.5方法進行處理后，按照1.4.4儀器條件進行測定，根據峰面積采用外標法計算檸檬酸含量，結果滿意。

3 討論

3.1 液相色譜法試驗情況

取不同廠家的10個葡萄酒樣品，采用國家標準GB/T 15038—2006中液相色譜法測定葡萄酒中的檸檬酸，樣品經稀釋后直接用液相色譜儀分析，其中7個葡萄酒樣品的液相色譜無法將樣品中其他組分與檸檬酸完全分離（如圖2所示），這樣極易造成定性判定錯誤，并造成檢測結果定量不準確[2]。另外3個葡萄酒樣品的液相色譜基本能將樣品中其他組分與檸檬酸分離（如圖3所示），但色譜基線波動大，僅靠保留時間定性定量，也很難保證檢測結果的準確性。

3.2 高效液相色譜-串聯質譜法試驗情況

取上述不同廠家的10個葡萄酒樣品，經稀釋后采用此液相色譜-串聯質譜法檢測，10個葡萄酒樣品的MRM色譜圖與檸檬酸不同濃度標準溶液及葡萄酒樣品1、樣品2的MRM圖基本一致（見圖4），葡萄酒樣品溶液中的檸檬酸峰型極好，周圍無雜峰干擾，基線平穩，不受樣品中復雜基質的影響，能準確完成葡萄酒樣品中檸檬酸的定性定量分析。

4 結論

經過試驗比較驗證，葡萄酒樣品經簡單稀釋處理，選擇高效液相色譜-串聯質譜法儀檢測，可以得到準確的檸檬酸的定性定量結果。說明高效液相色譜-串聯質譜法準確、高效、重現性好，并能有效消除樣品中其他組分對目標峰的干擾，靈敏度高、定性定量準確、檢出限低，可用來準確分析葡萄酒中檸檬酸含量。