1-MCP處理對早酥梨衰老的影響

張海霞

（武威職業學院，甘肅 武威 733000）

早酥梨作為西北地區主栽產品之一，成熟于8月中旬，果形美觀，果皮翠綠、光滑，肉質細嫩，風味好，水分多，品質上乘[1-2]，深受消費者歡迎。其主要銷售市場在廣州、福建等南方地區，在市場上具有很強的競爭力。但上市時正值酷暑高溫，果實呼吸作用強，容易造成果皮發黃、肉質變軟，失去了原有的商品性狀，使貨架期大大縮短，令種植戶和銷售商遭受巨大的經濟損失[3]。因此，解決早酥梨的生理衰老問題對于推進優質梨基地的產業化、提高經濟效益有重要意義。

乙烯是成熟衰老激素[4]，在果蔬貯藏過程中，乙烯能促進果蔬的成熟衰老。近幾年來，人們在尋求更有效的抗乙烯生理作用的化學物質的方面，發現有一些環丙烯化合物能夠和乙烯受體發生不可逆結合，進而對乙烯效應產生強烈的抑制作用，如CP（亞甲基環丙烯）、3，3-DMCP（3，3-二甲基環丙烯）、1-MCP（1-甲基環丙烯）和3-MCP（3-甲基環丙烯），其中1-MCP的效果最佳，它具有無毒、穩定、使用濃度低等特點。

1-MCP屬于乙烯競爭性抑制劑，不僅可以阻止受體與乙烯的正常結合，還能與乙烯受體進行不可逆結合，從而阻礙乙烯信號傳導，起到延緩成熟的作用，能夠明顯延長呼吸躍變型果實的貯藏期和貨架期。國內外對它的研究多地集中在花卉和果品上，并取得了一些較理想的結果。汪俏梅、郭得平等在青花菜的研究中發現，經1-MCP處理的青花菜其貯藏期間的MDA含量呈現出下降趨勢，而CAT和SOD兩者的活性在不斷增大，說明1-MCP處理可以對抗氧化酶系統進行調節而使青花菜的衰老得以延緩[5]。白華飛，楊曉棠等用1-MCP處理青棗，發現1-MCP能夠有效減緩果實膜透性的增大，丙二醛含量遠低于對照，并提高了青棗SOD、POD的活性[6]。李敏等用0.25μl/L 1-MCP處理臺農果實，不僅能夠使果實失重率降低，可滴定酸含量的下降推遲，還能夠抑制PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的增加，從而延緩果實的后熟作用[7]。高敏和張繼澍的研究發現，1-MCP處理能夠明顯抑制SOD（超氧化物歧化酶）和POD（過氧化物酶）活性在前期的上升和后期的下降[8]。

目前，關于1-MCP在水果貯藏保鮮上應用的研究報道不少，但尚未見到將1-MCP應用于早酥梨抗氧化酶的研究。本研究以早酥梨為材料，用不同濃度的1-MCP處理果實，研究常溫貯藏期間果實黃化、丙二醛含量、細胞膜透性及三種抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的變化，為早酥梨采后衰老的控制提供理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

早酥梨采收自甘肅景泰縣條山農場一個管理良好的盛果期果園，8月中旬采摘，選擇無機械損傷、無病蟲害、大小均勻的果實進行套袋裝箱，并于當天運回實驗室進行處理。試驗試劑：1-MCP（1-甲基環丙烯，商品名：安喜培），片劑（由臺灣利統公司生產）。

1.2 材料處理方法

準確稱取0.5 g、1.0 g、1.5 g的1-MCP分別置于3個小燒杯中，分別與待處理的果品同置于1 m3的塑料帳中，向燒杯中分別加入15 mL、30 mL和45 mL的蒸餾水并立即密封帳子，使帳內氣體濃度分別達到0.5μl/L、1.0μl/L、1.5μl/L，常溫密閉熏蒸12 h，待熏蒸結束，即刻將果實裝進紙箱于常溫下貯藏。對照組果實以空氣中密閉12 h后裝入紙箱同樣于常溫下貯藏。每處理用果40個，重復試驗3次，定期（0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d）取樣測定。

1.3 試驗測定方法

1.3.1 果皮黃化指數的評估

將黃化指數分為4級，即果皮全綠（1級）、果皮綠微黃（2級）、果皮淺黃（3級）、果皮全黃（4級），如果黃化指數大于等于3級，則認為其已經到達了貨架末期。在常溫放置期間，通過視覺感官評定方法對早酥梨的黃化指數進行評估。

1.3.2 組織膜透性的測定

參照張昭其等[9]方法并修改。在5個果實相同部位切取1 mm厚的薄片組織15片，用無離子水沖洗3次后用濾紙吸干組織表面水分，再放入燒杯中加入40 mL無離子水，采用電導儀測定初始及3 h后的電導率，測定溫度為25℃，然后將燒杯放入95℃的水浴箱中進行水浴，水浴30 min測定最終電導率，計算細胞膜完整率，見公式（1）。

1.3.3 MDA（丙二醛含量）測定

參照Hodgesetal[10]方法。用紫外分光光度計（導津UV-2450）測出反應液在450 nm、532 nm和600 nm三處的吸光度值，再運用公式計算反應液中MDA的濃度（CMDA）和果實樣品中MDA的含量（nmol?g FW-1）。計算公示如下：

1.3.4 POD（過氧化物酶）活性測定

參考李合生[11]方法。將3 g果肉組織放入研缽中，加3 mL磷酸緩沖液（0.05 mol/L、pH5.9的磷酸緩沖液，每100 mL中加入PVP0.5 g）和石英砂少許，在冰浴條件下快速研磨至勻漿，再在4℃的條件下以8 000 r/min離心20 min，獲得上清液，即酶粗提液。測定POD活性時，分別取1.8 mL愈創木酚（0.05 mol/L）、30μl經稀釋的酶液（50μl酶液加150μl磷酸緩沖液）和100μl H2O22%進行混合，混勻后于470 nm波長下比色，每隔1 min記錄1次吸光度，共記錄3次。以每分鐘內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（u）。見公式（4）。

式中：△A470——反應時間內吸光度的變化；W——果實鮮質量，g；t——反應時間，min；Vt——提取酶液總體積，mL；Vs——測定時取用酶液體積，mL。

1.3.5 SOD（超氧化物歧化酶）活性測定

粗酶液提取參照Lacan and Baccou[12]方法。

從6個果實中獲取果肉樣品3.0 g，加入3 mL提前預冷的pH 7.5的磷酸緩沖液（含5 mmol/L二硫蘇糖醇和2%PVP）100 mmol/L，在冰浴條件下快速研磨至勻漿后，在4℃的條件下以12 000×g離心30 min，收集上清液用于CAT和SOD兩項指標的測定。

SOD活性測定：使用10 mL指形玻璃管，依次加入磷酸緩沖液（1.5 mL，50 mmol/L）、甲硫氨酸（MET）溶液（0.3 mL，130 mmol/L）、氮藍四唑（NBT）溶液（0.3 mL，750μmol/L）、EDTANa2溶液（0.3 mL，100μmol/L）和酶提取液（0.3 mL），最后加入核黃素（0.3 mL，20μmol/L）。對照2支玻璃管中的酶液用緩沖液代替，混勻后將其中1支玻璃管放在暗處，其他各玻璃管均放在4 000 lx日光燈下反應15 min。反應完成后，以暗處放置的玻璃管液體做空白參照，分別測定其他各玻璃管混合液在560 nm處的吸光度值。SOD活性以每毫克蛋白抑制氮藍四唑（NBT）光化還原的50%為一個酶活性單位（U）表示。

1.3.6 CAT（過氧化氫酶）活性測定

參考Larrigaudièreetal等[13]人方法，將3 mL 10 mmol/L H2O2（以50 mmol/L pH7.5的磷酸緩沖液配制）和100μl粗酶液混合構成酶促反應體系，記錄2 min內自酶液加入后每隔30 s反應體系于240 nm處的吸光度值。酶活性用△OD240?min-1?mg-1蛋白質表示。

1.3.7 蛋白含量的測定

根據Bradford[14]考馬斯亮藍法，以G-250型考馬斯亮藍溶液和牛血清蛋白混合液的吸光度制作標準曲線，回歸方程y=0.834 7x-0.047 5，x=吸光度（0.556-1.032），y=蛋白值。樣品測定時，在50μl粗酶液中加入2 mL G-250型考馬斯亮藍溶液，充分混合2 min后倒入比色皿中，1 min后于595 nm波長下吸光度值，根據吸光度查標準曲線。

1.4 數據統計分析

全部試驗數據用Microsoft Excel計算平均值和標準誤差并制圖。

2 結果與分析

2.1 1-MCP處理對果皮黃化指數的影響

由圖1可以看出，在常溫貯藏期間，隨著貯藏期的延長，早酥梨果皮的黃化指數逐漸升高；對照組在第12 d就到了貨架末期（果皮淺黃），第20 d時果皮全黃，黃化指數達到4級；1-MCP 0.5μl/L處理在第16 d時果皮綠微黃（2級），第20 d時果皮綠微黃（2級）；經1-MCP1.0與1-MCP1.5μl/L處理的果實在整個貯藏期間黃化指數始終保持在1級，說明1-MCP處理能夠明顯延緩早酥梨果皮的黃化，延長早酥梨的貯藏期，其中以1-MCP1.0與1-MCP1.5μl/L效果最好。

圖1 1-MCP處理對果皮黃化指數的影響Fig.1 Effect on pericarp yellowing index

2.2 1-MCP處理對細胞膜透性的影響

由圖2可知，貯藏期間組織細胞膜透性逐漸增加，貯藏前期對照和處理之間差異不明顯，貯藏8 d后，對照果皮膜透性迅速增加，而經過1-MCP處理的其增長均比較緩慢，20 d后，差異效果最為顯著。對照組膜透性為63%，經0.5μl/L、1.0μl/L和1.5μl/L處理的果實其膜透性分別為52%、38%、40%，分別比對照減少了11%、25%、23%，可見1-MCP顯著減緩了細胞膜透性的增加，表明1-MCP處理能在一定程度上維持細胞膜的完整性。其中以濃度為1.0μl/L、1.5μl/L的效果最好。

圖2 1-MCP處理對細胞膜透性影響Fig.2 Effect on cell membrane permeability

2.3 1-MCP處理對丙二醛（MDA）含量的影響

膜結構的破壞是膜脂過氧化作用的結果，MDA是膜脂過氧化降解的典型產物，通常把MDA含量作為植物衰老的指標之一。除對照和0.5μl/L 1-MCP處理的果實外，其他兩組處理的MDA含量在貯藏期間是不斷增加的（見圖3）。處理組MDA含量始終低于對照，而且隨著貯藏天數的增加，處理與對照之間的差異越來越明顯，在16 d時，經0.5μl/L、1.0μl/L和1.5μl/L 1-MCP處理的果實其MDA含量分別是對照組的85%、72%、67%，說明1-MCP減緩了膜質過氧化程度，減少了MDA的積累，延緩了早酥梨的衰老。

圖3 1-MCP處理對丙二醛（MDA）含量的影響Fig.3 Effect on malondialdehyde content

2.4 1-MCP處理對過氧化物酶（POD）活性的影響

在貯藏前期對照與處理的POD活性變化不大，隨著貯藏天數的增加，差異效果越來越明顯，并且POD活性呈現先增加后降低的趨勢，并且都在貯藏至12 d時POD活性達到最高值，不同濃度1-MCP的處理并沒有影響到POD活性峰值的出現時間，但都不同程度的增加了POD的活性。其中以濃度為1.0μl/L、1.5μl/L處理的效果最顯著（見圖4）。

圖4 1-MCP處理對過氧化物酶（POD）活性的影響Fig.4 Effect on peroxidase activity

2.5 1-MCP處理對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

SOD能夠清除植物組織內的超氧自由基，延緩組織的衰老。各處理SOD的活性都呈現逐漸降低的趨勢（見圖5）。

圖5 1-MCP處理對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響Fig.5 Effect on superoxide dismutaseactivity

1-MCP較對照下降緩慢，酶活性大大高于對照，貯藏前期，對照與處理的差異不顯著，隨著貯藏天數的增加，對照與處理差異越來越明顯。貯藏至20 d時，經濃度0.5μl/L、1.0μl/L、1.5μl/L處理的果實其SOD活性分別為對照的1.67、2.03、2.23倍。說明1-MCP能使果實保持較高的SOD活性，起到延緩衰老的作用，以1.0μl/L、1.5μl/L的處理效果最顯著。

2.6 1-MCP處理對過氧化氫酶（CAT）活性的影響

隨著貯藏時間的延長，各處理組的CAT水平均表現出先上升后下降的趨勢。對照組在貯藏至第8 d時達到最大值，而經1-MCP處理的果實其CAT活性在10 d達到最高，同時，貯藏后期經1-MCP處理的果實CAT活性的下降較對照組也明顯緩慢，表明1-MCP可以延緩早酥梨果實常溫貯藏前期CAT活性的增加及貯藏后期CAT活性的降低（見圖6）。

圖6 1-MCP處理對過氧化氫酶（CAT）活性的影響Fig.6 Effect on catalase activity

3 討論與總結

綠色果蔬的黃化和果實的顏色變化是成熟與衰老的顯著標志之一，在這個過程中，伴隨的是葉綠素的迅速降解。研究證實，細胞組織損傷、衰老或死亡與機體中膜脂過氧化作用的加強，MDA、活性氧及自由基含量的不斷增加有著密切的關系。作為細胞中的保護性酶類，CAT、SOD、POD等能夠有效地清除活性氧自由基使細胞內活性氧的平衡得以調解進而延緩組織衰老。鑒于此，采取有效措施對保護性酶類的活性進行調節以實現延緩衰老可以作為今后研究的重點和努力的方向。

本試驗表明，采用1-MCP處理早酥梨，可以延緩早酥梨果皮的黃化速度，降低細胞膜透性的增加和MDA的積累，抑制SOD、POD及CAT的活性的下降，從而延緩果實衰老。這與張昭其在臺灣青棗的研究上具有相似性[9]。