山西不同產地野生葛根外植體滅菌條件優化分析

張 靜，王剛獅，劉瑞霞，時寶凌，廉梅霞

（山西林業職業技術學院，山西 太原 030009）

1 材料與方法

1.1 材料

選擇3種質地具有明顯差異、代表不同生長階段的山西野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi根作為材料，具體情況見表1。愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基。

表1 3種野葛根外植體來源及質地Tab.1 Source and textureof threewild Radix Puerariae explants

1.2 方法

將采集回的新鮮野葛根材料去掉葉片，用毛刷輕輕將根表面的泥土去掉，選擇根表皮完整、無破損的葛根作為試驗材料。將其切成10 cm左右的根段，挑選粗細均勻、并各自分成6組（共18組）放入錐形瓶內，分別置于超凈工作臺，錐形瓶內分別加入質量分數75%乙醇，晃動30 s，再分別移入質量分數0.1%、0.2%的HgCl2溶液中消毒8 min、10 min和12 min（見表2）。隨后，無菌水沖洗5次，用鑷子和手術刀去掉根兩端變黑的部分，將消毒后的外植體切成0.5 cm長的小段，接種于MS培養基上。每瓶接種4塊消毒后的外植體，每個處理接種6瓶。置于25℃的人工氣候箱中，黑暗培養，每3 d觀察記錄1次外植體污染與愈傷組織誘導情況。

表2 葛外植體消毒滅菌處理Tab.Disinfection and sterilization of Radix Puerariae explants

2 結果

觀察發現，在接種后4 d，有些外植體的表面便開始出現白色的霉菌菌絲，表明消毒不徹底。培養9 d，所有消毒未達標的外植體表面均長出白色菌絲體。外植體污染與愈傷組織誘導情況見圖1~圖3。

圖1 大同市靈丘縣產野葛外植體消毒滅菌試驗結果Fig.1 Results of wild Radix Puerariae explants in Lingqiu County

圖3 晉城市澤州縣產野葛外植體消毒試驗結果Fig.3 Resultsof wild Radix Puerariae explantsin Zezhou County

死亡率=未出現愈傷組織塊數/未污染的接種塊數

由圖1可知，脆、嫩、表皮淺褐色的大同靈丘野葛在質量分數0.1%的HgCl2溶液中消毒8 min、10 min、12 min，雖然根細胞死亡率為0，但無法達到理想滅菌效果，污染率高達83.3%~67.5%；在質量分數0.2%的HgCl2中，滅菌時間10 min，污染率雖減少為4.1%，但在殺死細菌等微生物的同時，植物根細胞也被殺死，死亡率為17.5%；當質量分數0.2%HgCl2消毒12 min時，污染率雖然0，但33.3%的外植體均被殺死。因此，脆、嫩、表皮淺褐色的大同靈丘野葛根的最佳消毒條件為：質量分數75%乙醇處理時間30 s，質量分數0.2%的HgCl2溶液浸泡8 min，此時，污染率為8.3%，死亡率為5%。

由圖2可知，堅實、較嫩、表皮淺褐色的運城平陸產野葛的最佳滅菌條件為：質量分數75%酒精處理時間30 s，質量分數0.2%的HgCl2溶液浸泡8 min。在此條件下外植體的污染率為10.2%，外植體死亡率為0。

圖2 運城市平陸縣產野葛外植體消毒試驗結果Fig.2 Resultsof wild Radix Puerariae explantsin Pinglu County

由圖3可知，堅實、較硬、表皮粗糙、深褐色的晉城澤州產野葛的最佳滅菌條件為：質量分數75%乙醇處理時間30 s，質量分數0.2%HgCl2溶液消毒10 min。在此條件下外植體的污染率為5.7%，死亡率為32.2%。

3 討論

組織培養的第一步是獲得無菌的外植體，而不同情況的外植體應該選擇其適宜的滅菌試劑與方法，特別是珍貴、不易獲得的材料。若外植體消毒方法不當，可能導致試驗材料損失，無法進行后續試驗。因此，選用合適的消毒劑種類、濃度與滅菌時間是解決污染的關鍵[1]。常用的消毒試劑有質量分數75%乙醇、HgCl2。質量分數75%乙醇具有較強的穿透力與殺傷力，是最常用的表面消毒劑，但其對組織、細胞的傷害程度也高，通常與其他消毒劑配合使用[1]。HgCl2是目前殺菌效果最好的消毒劑，其殺菌原理是Hg+與帶負電荷的蛋白質結合，導致蛋白質變性[2]，從而殺死細菌等微生物，但HgCl2更易外植體表面殘留，汞又較難去除，因此，使用后需用無菌水沖洗多次，降低汞的殘留。本試驗采用質量分數75%乙醇配合不同濃度的HgCl2對不同來源的野葛外植體進行消毒，均達到了理想的效果。其中大同靈丘產野葛，只需質量分數75%乙醇處理時間30 s、質量分數0.2%的HgCl2溶液消毒8 min即可達到理想效果；晉城澤州產野葛質地較硬、根段中間深褐色、枯朽，代謝緩慢使用質量分數0.2%的HgCl2溶液消毒10 min，雖然可以殺滅絕大多數的體表微生物，污染率為5.7%，但外植體的1/3死亡。

在制定消毒方案時，還需要考慮到外植體的采集季節、所處的生理狀態等[3]。對于在野外、大田采集到的外植體，表面帶有大量的泥土，特別是根作為外植體污染率會更高，但考慮到野葛根中含有較高的次級代謝產物，有利于后期葛根素、異黃酮等有效成分的獲得，因此應當選擇生長旺盛期、代謝快、顏色淺、質地脆嫩的葛根作為外植體。在外植體采集時，還應當避免陰雨天等潮濕天氣，潮濕的空氣更加適合雜菌的生長，從而增加外植體的污染率。在本試驗中，大同市靈丘產的野葛根脆、嫩、表皮淺褐色，內源激素充足、具有更強的抗菌能力；而晉城澤州產野葛處于生長衰退階段，深褐色、枯朽，不僅污染率高，外植體活性較弱、抗逆性差，不是理想的外植體材料。